Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Сборка Гибсона - это метод молекулярного клонирования, который позволяет объединять несколько фрагментов ДНК в одной изотермической реакции. Он назван в честь его создателя Дэниела Дж. Гибсона, который был техническим директором и соучредителем Codex DNA .

Процесс [ править ]

Обзор сборки Gibson

Вся реакция сборки Гибсона требует нескольких компонентов с незначительными манипуляциями. [1]

Метод позволяет одновременно комбинировать до 15 фрагментов ДНК в зависимости от идентичности последовательностей. Это требует, чтобы фрагменты ДНК содержали ~ 20-40 пар оснований, перекрывающихся с соседними фрагментами ДНК. Эти фрагменты ДНК смешиваются с коктейлем из трех ферментов вместе с другими компонентами буфера.

Три необходимых активности фермента: экзонуклеаза , ДНК-полимераза и ДНК-лигаза .

  • Экзонуклеаза отщепляет ДНК с 5'-конца, таким образом, не ингибируя активность полимеразы и позволяя реакции протекать в одном единственном процессе. [1] Образующиеся одноцепочечные области на соседних фрагментах ДНК могут отжигаться.
  • ДНК-полимераза включает нуклеотиды, чтобы заполнить любые пробелы.
  • ДНК-лигаза ковалентно соединяется с ДНК соседних сегментов, тем самым удаляя любые разрывы в ДНК.

Полученный продукт - это разные фрагменты ДНК, объединенные в один. Могут быть собраны как линейные, так и замкнутые круговые молекулы.

Есть два подхода к сборке Гибсона. Одноэтапный метод и двухэтапный метод. Оба метода можно проводить в одном реакционном сосуде. Одношаговый метод сборки Гибсона позволяет собрать до 5 различных фрагментов с использованием одноступенчатой изотермическойпроцесс. В этом методе фрагменты и основная смесь ферментов объединяются, и вся смесь инкубируется при 50 ° C в течение одного часа. Для создания более сложных конструкций, содержащих до 15 фрагментов, или для конструкций, включающих фрагменты от 100 до 10 т.п.н., используется двухэтапный подход сборки Гибсона. Двухступенчатая реакция требует двух отдельных добавлений мастер-микса; один для стадии экзонуклеазы и отжига, а второй для стадии ДНК-полимеразы и лигирования. При двухэтапном подходе для выполнения процесса сборки используются разные температуры инкубации.

Преимущества [ править ]

Этот метод сборки ДНК имеет много преимуществ по сравнению с обычным клонированием рекомбинантной ДНК рестрикционным ферментом / лигированием.

  • Никакого рестрикционного переваривания фрагментов ДНК после ПЦР не требуется. Однако основной вектор можно переваривать или синтезировать с помощью ПЦР.
  • Это дешевле и быстрее, чем обычные схемы клонирования, так как требует меньшего количества этапов и меньшего количества реагентов.
  • Между двумя фрагментами ДНК не остается рубца сайта рестрикции, но область между двойными цепями и свисающими концами немного подвержена мутации, когда ДНК-полимераза закрывает промежутки.
  • До 5 фрагментов ДНК можно объединить одновременно в реакции в одной пробирке с использованием одностадийной мастер-смеси ферментов.
  • Одновременно можно объединить до 15 фрагментов с помощью двухэтапной реакции. При двухэтапном подходе сначала выполняются этапы экзонуклеазы и отжига. После этого на втором этапе добавляют ДНК-полимеразу и лигазу.
  • Метод сборки Гибсона также можно использовать для сайт-направленного мутагенеза для включения сайт-специфических мутаций, таких как вставки, делеции и точечные мутации.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Гибсон Д.Г., Янг Л., Чуанг Р.Й., Вентер Дж. К., Хатчисон, Калифорния, 3-й, Смит Х.О. (2009). «Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз». Методы природы . 6 (5): 343–345. DOI : 10.1038 / nmeth.1318 . PMID  19363495 .

Дополнительная информация [ править ]