Индуцированные стволовые клетки

Индуцированные стволовые клетки ( iSC ) - это стволовые клетки, полученные из соматических , репродуктивных , плюрипотентных или других типов клеток путем преднамеренного эпигенетического репрограммирования. Они классифицируются как тотипотентные (iTC), плюрипотентные (iPSC) или предшественники (мультипотентные - iMSC, также называемые индуцированной мультипотентной клеткой-предшественником - iMPC) или унипотентные - (iUSC) в соответствии с их потенциалом развития и степенью дедифференцировки . Прародители получают путем так называемого прямого репрограммирования или направленной дифференцировки.их также называют индуцированными соматическими стволовыми клетками .

Широко известны три метода: ^[1]

• Трансплантация ядер, взятых из соматических клеток, в ооцит (яйцеклетку) без собственного ядра (удалено в лаборатории) ^{[2] [3] [4] [5]}
• Слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками ^[6] и
• Трансформация соматических клеток в стволовые клетки с использованием генетического материала, кодирующего факторы репрограммирующего белка , ^{[7] [8] [9]} рекомбинантные белки; ^[10] микроРНК, ^{[11] [12] [13] [14] [15]} синтетическая самовоспроизводящаяся полицистронная РНК ^[16] и низкомолекулярные биологически активные вещества. ^{[17] [18] [19]}

Природные процессы [ править ]

В 1895 году Томас Морган удалил один из двух бластомеров лягушки и обнаружил, что земноводные способны образовывать целые эмбрионы из оставшейся части. Это означало, что клетки могут изменять свой путь дифференцировки. В 1924 году Спеманн и Мангольд продемонстрировали ключевое значение межклеточной индукции в процессе развития животных. ^[20] Обратимое преобразование клеток одного дифференцированного типа клеток в другой называется метаплазией . ^[21] Этот переход может быть частью нормального процесса созревания или вызван побуждением.

Одним из примеров является трансформация клеток радужной оболочки в клетки хрусталика в процессе созревания и трансформация клеток пигментного эпителия сетчатки в нервную сетчатку во время регенерации у взрослых глаз тритона . Этот процесс позволяет организму заменять клетки, не подходящие для новых условий, более подходящими новыми клетками. В имагинальных дисках дрозофилы клетки должны выбирать из ограниченного числа стандартных дискретных состояний дифференцировки. Тот факт, что трансдетерминация (изменение пути дифференцировки) часто происходит для группы клеток, а не для отдельных клеток, показывает, что она индуцируется, а не является частью созревания. ^[22]

Исследователи смогли определить минимальные условия и факторы, которых будет достаточно для запуска каскада молекулярных и клеточных процессов, чтобы дать плюрипотентным клеткам команду организовать эмбрион . Они показали , что противоположные градиенты из костных морфогенетического белка (BMP) и Nodal , два трансформирующих фактор роста членов семьи , которые действуют как морфогены , являются достаточным , чтобы вызвать молекулярные и клеточные механизмы , необходимые для организации, в естественных условиях или в пробирке , неподтвержденные клетки на данио бластулы животный полюс в хорошо развитый эмбрион. ^[23]

Некоторые типы зрелых специализированных взрослых клеток могут естественным образом превращаться в стволовые клетки. Например, «главные» клетки экспрессируют маркер стволовых клеток Troy. Хотя они обычно производят пищеварительную жидкость для желудка, они могут превращаться в стволовые клетки для временного ремонта повреждений желудка, таких как порез или повреждение от инфекции. Более того, они могут совершать этот переход даже при отсутствии заметных повреждений и способны восполнять целые желудочные единицы, по сути служа неподвижными «резервными» стволовыми клетками. ^[24] Дифференцированные эпителиальные клетки дыхательных путей могут превращаться в стабильные и функциональные стволовые клетки in vivo . ^[25]После повреждения зрелые окончательно дифференцированные клетки почек дедифференцируются в более примордиальные версии самих себя и затем дифференцируются в типы клеток, нуждающиеся в замене в поврежденной ткани ^[26]. Макрофаги могут самообновляться за счет локальной пролиферации зрелых дифференцированных клеток. ^{[27] [28]} У тритонов мышечная ткань регенерируется из специализированных мышечных клеток, которые дедифференцируются и забывают, каким типом клеток они были. Эта способность к регенерации не снижается с возрастом и может быть связана с их способностью производить новые стволовые клетки из мышечных клеток по мере необходимости. ^[29]

Различные неопухолевые стволовые клетки обладают способностью генерировать несколько типов клеток. Например, многолинейно дифференцирующиеся стрессоустойчивые (Muse) клетки представляют собой стрессоустойчивые стволовые клетки взрослого человека, которые могут самообновляться. Они образуют характерные кластеры клеток в суспензионной культуре, которые экспрессируют набор генов, связанных с плюрипотентностью, и могут дифференцироваться в энтодермальные , эктодермальные и мезодермальные клетки как in vitro, так и in vivo. ^{[30] [31] [32] [33] [34]}

Подробно описаны другие хорошо задокументированные примеры трансдифференцировки и их значение в развитии и регенерации. ^{[35] [36]}

Индуцированные тотипотентные клетки [ править ]

SCNT-опосредованный [ править ]

Индуцированные тотипотентные клетки можно получить путем перепрограммирования соматических клеток с помощью переноса ядра соматических клеток (SCNT). Процесс включает в себя отсасывание ядра соматической (телесной) клетки и введение его в ооцит, ядро ​​которого было удалено ^{[3] [5] [37] [38] [39] [40]}

Используя подход, основанный на протоколе, описанном Tachibana et al., ^[3] hESCs могут быть созданы с помощью SCNT с использованием ядер дермальных фибробластов как у 35-летнего мужчины среднего возраста, так и у пожилого мужчины 75 лет, предполагая, что возрастные изменения не обязательно являются препятствием для ядерного репрограммирования человеческих клеток на основе SCNT. ^[41] Такое перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентное состояние имеет огромные возможности для регенеративной медицины . К сожалению, клетки, созданные с помощью этой технологии, потенциально не полностью защищены от иммунной системы пациента (донора ядер), поскольку у них одинаковые митохондрии.ДНК, как донор ооцитов, вместо митохондриальной ДНК пациентов. Это снижает их ценность как источника терапии по трансплантации аутологичных стволовых клеток , так как в настоящее время ^[42] не ясно, может ли она вызвать иммунный ответ пациента после лечения.

Индуцированные андрогенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки можно использовать вместо сперматозоидов для клонирования. Эти клетки, синхронизированные в фазе М и введенные в ооцит, могут дать жизнеспособное потомство. ^[43]

Эти разработки, вместе с данными о возможности получения неограниченного количества ооцитов из митотически активных репродуктивных стволовых клеток ^[44], предлагают возможность промышленного производства трансгенных сельскохозяйственных животных. Повторное повторное клонирование жизнеспособных мышей с помощью метода SCNT, который включает ингибитор гистондеацетилазы , трихостатин, добавленный в среду для культивирования клеток, ^[45] показывает, что можно повторно клонировать животных на неопределенный срок без видимого накопления ошибок перепрограммирования или геномных ошибок ^[46] Однако исследования технологий получения сперматозоидов и яйцеклеток из стволовых клеток поднимают биоэтические проблемы. ^[47]

Такие технологии также могут иметь далеко идущие клинические применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека. ^{[3] [48]} Например, технология может предотвратить передачу наследственных митохондриальных заболеваний будущим поколениям. Митохондриальный генетический материал передается от матери к ребенку. Мутации могут вызывать диабет, глухоту, заболевания глаз, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, слабоумие и другие неврологические заболевания. Ядро одного человеческого яйца было перенесено в другое, включая его митохондрии, в результате чего была создана клетка, которая может считаться имеющей двух матерей. Затем яйца были оплодотворены, и полученные эмбриональные стволовые клетки несли замененную митохондриальную ДНК. ^[49]В качестве доказательства того, что метод безопасен, автор этого метода указывает на существование здоровых обезьян, которым сейчас более четырех лет, и которые являются продуктом митохондриальных трансплантатов с разным генетическим происхождением. ^[50]

У мышей с дефицитом теломеразы (Terc - / -) позднего поколения репрограммирование, опосредованное SCNT, смягчает дисфункцию теломер и митохондриальные дефекты в большей степени, чем репрограммирование на основе iPSC. ^[51]

Были описаны другие достижения в клонировании и тотипотентной трансформации. ^[52]

Получено без SCNT [ править ]

Недавно некоторым исследователям удалось получить тотипотентные клетки без помощи SCNT. Тотипотентные клетки получали с использованием эпигенетических факторов, таких как зародышевая изоформа гистона ооцита. ^[53] Перепрограммирование in vivo путем временной индукции четырех факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc у мышей придает свойства тотипотентности. Внутрибрюшинная инъекция таких iPS-клеток in vivo генерирует эмбрионоподобные структуры, которые экспрессируют эмбриональные и внеэмбриональные ( трофэктодермальные ) маркеры. ^[54] Потенциал развития плюрипотентных стволовых клеток мыши для получения как эмбриональных, так и экстраэмбриональных клонов также может быть увеличен за счет дефицита микроРНК miR-34a , что приводит к сильной индукции эндогенных ретровирусов.МУЭРВ-Л (MERVL). ^{[55] [56]}

Омоложение до ИПСК [ править ]

ИПСК впервые были получены в форме трансплантируемой тератокарциномы, индуцированной трансплантатами, взятыми из эмбрионов мыши. ^[57] Тератокарцинома образовалась из соматических клеток. ^[58] Генетически мозаичные мыши были получены из клеток злокачественной тератокарциномы, что подтверждает плюрипотентность этих клеток. ^{[59] [60] [61]} Оказалось, что клетки тератокарциномы способны поддерживать культуру плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток в недифференцированном состоянии, снабжая культуральную среду различными факторами. ^[62] В 1980-х годах стало ясно, что трансплантация плюрипотентных / эмбриональных стволовых клеток в организм взрослых млекопитающих обычно приводит к образованиютератомы , которые затем могут превратиться в злокачественную тератокарциному. ^[63] Однако введение клеток тератокарциномы в эмбрион на стадии бластоцисты привело к их включению во внутреннюю клеточную массу и часто приводило к образованию нормального химерного (то есть состоящего из клеток разных организмов) животного. ^{[64] [65] [66]} Это указывает на то, что причиной тератомы является диссонанс - взаимное недопонимание между молодыми донорскими клетками и окружающими взрослыми клетками (так называемая « ниша » реципиента ).

В августе 2006 г. японские исследователи отказались от ооцита, как в случае с SCNT. Путем перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши в плюрипотентные стволовые клетки посредством эктопической экспрессии четырех факторов транскрипции , а именно Oct4 , Sox2 , Klf4 и c-Myc , они доказали, что сверхэкспрессия небольшого числа факторов может подтолкнуть клетку к переходу в новую стабильную форму. состояние, связанное с изменением активности тысяч генов. ^[7]

Таким образом, механизмы репрограммирования связаны, а не независимы, и сосредоточены на небольшом количестве генов. ^[67] Свойства IPSC очень похожи на ESC. ^[68] ИПСК, как было показано, поддерживают развитие мышей, полностью использующих ИПСК, с использованием тетраплоидного (4n) эмбриона ^{[69], что} является наиболее строгим методом анализа потенциала развития. Однако некоторые генетически нормальные ИПСК не смогли продуцировать мышей, полностью содержащих ИПСК, из-за аберрантного эпигенетического молчания импринтированного кластера генов Dlk1-Dio3 . ^[18] Команда, возглавляемая Хансом Шёлером (открывшим ген Oct4 еще в 1989 году), показала, что сверхэкспрессия Oct4 вызывает массивную активацию нецелевого гена во время репрограммирования, ухудшая качество ИПСК. По сравнению с OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc), которые демонстрируют паттерны патологического импринтинга и дифференцировки, перепрограммирование SKM (Sox2, Klf4 и c-Myc) генерирует ИПСК с высоким потенциалом развития (почти в 20 раз выше, чем у OSKM). эквивалентно эмбриональным стволовым клеткам , что определяется их способностью генерировать мышей, полностью использующих ИПСК, посредством комплементации тетраплоидных эмбрионов ^{[70] [71]}

Важным преимуществом ИПСК перед ЭСК является то, что они могут происходить из взрослых клеток, а не из эмбрионов. Таким образом, появилась возможность получать ИПСК у взрослых и даже у пожилых пациентов. ^{[9] [72] [73]}

Перепрограммирование соматических клеток на ИПСК приводит к омоложению. Было обнаружено, что репрограммирование приводит к удлинению и последующему укорочению теломер после их дифференцировки обратно в фибробластоподобные производные. ^[74] Таким образом, репрограммирование ведет к восстановлению длины теломер эмбриона, ^[75] и, следовательно, увеличивает потенциальное число клеточных делений, иначе ограниченное пределом Хейфлика . ^[76]

Однако, из - за диссонанс между омоложенными клетками и окружающей нишей старых клеток реципиента, введение его собственной IPSC обычно приводит к иммунной реакции , ^[77] , которые могут быть использованы в медицинских целях, ^[78] или формированием опухоли, такие как тератома. ^[79] Причина была в том, что некоторые клетки, дифференцированные от ESC и iPSC in vivo, продолжают синтезировать изоформы эмбрионального белка . ^[80] Таким образом, иммунная система может обнаруживать и атаковать клетки, которые не взаимодействуют должным образом.

Небольшая молекула под названием MitoBloCK-6 может заставить плюрипотентные стволовые клетки умирать, вызывая апоптоз (через высвобождение цитохрома с через внешнюю мембрану митохондрий ) в плюрипотентных стволовых клетках человека, но не в дифференцированных клетках. Вскоре после дифференцировки дочерние клетки стали устойчивыми к гибели. Когда MitoBloCK-6 вводили в дифференцированные клеточные линии, клетки оставались здоровыми. Было высказано предположение, что ключ к их выживанию связан с изменениями, которым подвергаются митохондрии плюрипотентных стволовых клеток в процессе дифференцировки клеток. Эта способность MitoBloCK-6 разделять плюрипотентные и дифференцированные клеточные линии может снизить риск тератом и других проблем в регенеративной медицине. ^[81]

В 2012 году были идентифицированы другие небольшие молекулы (селективные цитотоксические ингибиторы плюрипотентных стволовых клеток человека - hPSC), которые предотвращают образование тератом у мышей плюрипотентными стволовыми клетками человека. Наиболее мощное и селективное из них (PluriSIn # 1) ингибирует стеароил-coA десатуразу (ключевой фермент биосинтеза олеиновой кислоты ), что в конечном итоге приводит к апоптозу. С помощью этой молекулы недифференцированные клетки могут быть выборочно удалены из культуры. ^{[82] [83]} Эффективная стратегия для селективного устранения плюрипотентных клеток с потенциалом тератомы ориентирован плюрипотентный стволовые клетки-специфические антиапоптотический фактор (ы) (то есть, сурвивиныили Bcl10). Однократное лечение химическими ингибиторами сурвивина (например, кверцетином или YM155) может вызвать селективную и полную гибель недифференцированных hPSC, и, как утверждается, этого достаточно для предотвращения образования тератомы после трансплантации. ^[84] Однако маловероятно, что какой-либо вид предварительного разрешения может обеспечить повторную посадку ИПСК или ESC. После избирательного удаления плюрипотентных клеток они быстро появляются снова, превращая дифференцированные клетки в стволовые, что приводит к опухолям. ^[85] Это может быть связано с нарушением регуляции let-7 его мишени Nr6a1 (также известного как ядерный фактор зародышевой клетки.- GCNF), эмбриональный репрессор транскрипции генов плюрипотентности, который регулирует экспрессию генов во взрослых фибробластах после потери микро-РНК miRNA. ^[86]

Формирование тератомы плюрипотентными стволовыми клетками может быть вызвано низкой активностью фермента PTEN, который , как сообщается, способствует выживанию небольшой популяции (0,1–5% от общей популяции) высоко канцерогенных, агрессивных, вызывающих тератому эмбрионоподобных клеток карциномы во время дифференцировки. . Выживание этих клеток, инициирующих тератомы, связано с неудачной репрессией Nanog, а также со склонностью к увеличению метаболизма глюкозы и холестерина. ^[87] Эти клетки, инициирующие тератому, также экспрессировали более низкое соотношение p53 / p21 по сравнению с неканцерогенными клетками. ^[88] В связи с указанными выше проблемами безопасности использование ИПСК для клеточной терапии все еще ограничено. ^[89]Однако их можно использовать для множества других целей, включая моделирование болезни, ^[90] скрининг (выборочный отбор) лекарств, тестирование на токсичность различных лекарств. ^[91]

Ткани выращены из ИПСК, помещают в «химерные» эмбрионов на ранних стадиях развития мыши, практически не вызывают реакции иммунного (после того, как зародыши выросли в взрослых мышей) и пригодны для аутологичной трансплантации ^[92] В то же время В то же время полное перепрограммирование взрослых клеток in vivo в тканях путем временной индукции четырех факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc у мышей приводит к тератомам, появляющимся из множества органов. ^[54] Более того, частичное репрограммирование клеток в сторону плюрипотентности in vivo у мышей демонстрирует, что неполное репрограммирование влечет за собой эпигенетические изменения (неудачная репрессия мишеней Polycomb и измененное метилирование ДНК ) в клетках, которые вызывают развитие рака.^[93] Однако позже ряду исследователей удалось провести циклическое частичное репрограммирование in vivo путем экспрессии факторов Яманака в течение короткого периода времени без последующего канцерогенеза и, таким образом, частично омолодить и продлить жизнь прогероидных мышей. ^{[94] [95]} С помощьюметода in vitro, использующего несколько более длительные периоды репрограммирования (для существенного омоложения), клетки временно теряют свою клеточную идентичность ^[96], но «восстанавливают свою первоначальную соматическую судьбу, когда факторы репрограммирования удаляются». ^[97]

Химическое побуждение [ править ]

Используя исключительно маленькие молекулы , Дэн Хункуй и его коллеги продемонстрировали, что эндогенных «главных генов» достаточно для репрограммирования судьбы клеток. Они индуцировали плюрипотентное состояние во взрослых клетках мышей с помощью семи низкомолекулярных соединений. ^[17] Эффективность метода довольно высока: он смог преобразовать 0,02% клеток взрослой ткани в ИПСК, что сопоставимо со скоростью конверсии вставки гена. Авторы отмечают, что мыши, полученные из CiPSCs, были «на 100% жизнеспособны и явно здоровы на срок до 6 месяцев». Таким образом, эта стратегия химического репрограммирования потенциально может использоваться для создания желаемых функциональных типов клеток для клинического применения. ^{[99] [100]}

В 2015 году была создана надежная система химического перепрограммирования с выходом в 1000 раз больше, чем в ранее сообщенном протоколе. Таким образом, химическое перепрограммирование стало многообещающим методом управления судьбой клеток. ^[101]

Дифференциация от индуцированной тератомы [ править ]

Тот факт, что ИПСК человека способны образовывать тератомы не только в организме человека, но и в организме некоторых животных, в частности у мышей или свиней, позволил разработать метод дифференциации ИПСК in vivo. С этой целью ИПСК с агентом, индуцирующим дифференцировку в клетки-мишени, вводят генетически модифицированной свинье или мыши, которые подавили активацию иммунной системы на клетках человека. Образовавшаяся тератома вырезается и используется для выделения необходимых дифференцированных клеток человека ^[102] с помощью моноклональных антител к тканеспецифическим маркерам на поверхности этих клеток. Этот метод успешно используется для получения функциональных миелоидных, эритроидных и лимфоидных клеток человека, пригодных для трансплантации (пока только мышам).^[103] Мыши, которым прививали гематопоэтические клетки, полученные из тератомы ИПСК человека, продуцировали В- и Т-клетки человека, способные к функциональным иммунным ответам. Эти результаты дают надежду на то, что создание in vivo индивидуальных клеток пациента возможно, обеспечивая материалы, которые могут быть полезны для трансплантации, получения человеческих антител и скрининга лекарств. Использование MitoBloCK-6 ^[81]и / или PluriSIn # 1, дифференцированные клетки-предшественники могут быть дополнительно очищены от тератомы, образующей плюрипотентные клетки. Тот факт, что дифференцировка происходит даже в нише тератомы, дает надежду на то, что полученные клетки будут достаточно стабильными, чтобы стимулы могли вызвать их переход обратно в дедифференцированное (плюрипотентное) состояние и, следовательно, безопасны. Сходная система дифференцировки in vivo, дающая прививаемые гемопоэтические стволовые клетки из ИПСК мыши и человека у животных с тератомой, в сочетании с маневром для облегчения гемопоэза, была описана Suzuki et al. ^[104]Они отметили, что ни лейкемия, ни опухоли не наблюдались у реципиентов после внутривенной инъекции полученных из ИПСК гемопоэтических стволовых клеток облученным реципиентам. Более того, эта инъекция привела к многолинейному и долгосрочному восстановлению гемолимфопоэтической системы при серийных переносах. Такая система представляет собой полезный инструмент для практического применения ИПСК при лечении гематологических и иммунологических заболеваний. ^[105]

Для дальнейшего развития этого метода животное, в котором выращивают трансплантат клетки человека, например мышь, должно иметь настолько модифицированный геном, чтобы все его клетки экспрессировали и имели на своей поверхности человеческий SIRPα . ^[106] Чтобы предотвратить отторжение после трансплантации пациенту аллогенного органа или ткани, выращенных из плюрипотентных стволовых клеток in vivo у животного, эти клетки должны экспрессировать две молекулы: CTLA4-Ig , который нарушает костимуляторные пути Т-клеток и PD- L1 , который активирует путь ингибирования Т-клеток. ^[107]

См. Также: патент США 20130058900  .

Дифференцированные типы клеток [ править ]

Клетки сетчатки [ править ]

В ближайшем будущем начнутся клинические испытания, призванные продемонстрировать безопасность использования ИПСК для клеточной терапии людей с возрастной дегенерацией желтого пятна, заболеванием, вызывающим слепоту из-за повреждения сетчатки. В нескольких статьях описаны методы получения клеток сетчатки из ИПСК ^{[108] [109]} и их использование для клеточной терапии. ^{[110] [111]} Сообщения о трансплантации пигментного эпителия сетчатки, полученного с помощью ИПСК, показали улучшенное визуально-управляемое поведение экспериментальных животных в течение 6 недель после трансплантации. ^[112] Однако клинические испытания были успешными: у десяти пациентов, страдающих пигментным ретинитом, было восстановлено зрение, в том числе у женщины, у которой осталось только 17 процентов зрения.^[113]

Эпителиальные клетки легких и дыхательных путей [ править ]

Хронические заболевания легких, такие как идиопатический фиброз легких и муковисцидоз, или хроническая обструктивная болезнь легких и астма, являются ведущими причинами заболеваемости и смертности во всем мире, вызывая значительное человеческое, социальное и финансовое бремя. Таким образом, существует острая необходимость в эффективной клеточной терапии и инженерии легочной ткани . ^{[114] [115]} Было разработано несколько протоколов для генерации большинства типов клеток дыхательной системы , которые могут быть полезны для получения терапевтических клеток, специфичных для пациента. ^{[116] [117] [118] [119] [120]}

Репродуктивные клетки [ править ]

Некоторые линии ИПСК обладают потенциалом дифференцироваться в мужские половые клетки и ооцитоподобные клетки в соответствующей нише (путем культивирования в ретиноевой кислоте и среде дифференцировки фолликулярной жидкости свиньи или трансплантации семенных канальцев). Более того, трансплантация ИПСК вносит вклад в восстановление семенников бесплодных мышей, демонстрируя возможность образования гамет из ИПСК in vivo и in vitro. ^[121]

Индуцированные стволовые клетки-предшественники [ править ]

Прямая трансдифференцировка [ править ]

Риск рака и опухолей создает необходимость в разработке методов более безопасных клеточных линий, подходящих для клинического использования. Альтернативный подход - так называемое «прямое репрограммирование» - трансдифференцировка клеток без перехода через плюрипотентное состояние. ^{[122] [123] [124] [125] [126] [127] [128]} Основой для этого подхода было то, что 5-азацитидин - реагент деметилирования ДНК - может вызывать образование миогенных , хондрогенных и адипогенных клонов в бессмертная клеточная линия эмбриональных фибробластов мыши ^[129] и что активация одного гена, позже названного MyoD1, достаточна для такого перепрограммирования. ^[130]По сравнению с ИПСК, для репрограммирования которых требуется не менее двух недель, образование индуцированных клеток-предшественников иногда происходит в течение нескольких дней, а эффективность репрограммирования обычно во много раз выше. Это перепрограммирование не всегда требует деления клеток. ^[131] Клетки, полученные в результате такого перепрограммирования, более подходят для клеточной терапии, поскольку они не образуют тератом. ^[127] Например, Chandrakanthan et al. И Pimanda описывают создание ткане-регенеративных мультипотентных стволовых клеток (iMS-клеток) путем временной обработки зрелых костных и жировых клеток фактором роста ( тромбоцитарный фактор роста.–AB (PDGF-AB)) и 5-азацитидин. Эти авторы утверждают, что: «В отличие от первичных мезенхимальных стволовых клеток, которые используются в клинической практике при незначительных объективных доказательствах для ускорения восстановления тканей, iMS-клетки вносят непосредственный вклад в регенерацию ткани in vivo контекстно-зависимым образом без образования опухолей», и поэтому значительный простор для применения в регенерации тканей ». ^{[132] [133] [134]}

Трансдифференцировка одного фактора транскрипции [ править ]

Первоначально только ранние эмбриональные клетки можно было уговорить изменить свою идентичность. Зрелые клетки устойчивы к изменению своей идентичности после того, как они перейдут к определенному виду. Однако кратковременная экспрессия одного фактора транскрипции, фактора ELT-7 GATA, может преобразовать идентичность полностью дифференцированных, специализированных неэнтодермальных клеток глотки в полностью дифференцированные кишечные клетки у интактных личинок и взрослых круглых червей Caenorhabditis elegans без потребности в дедифференцированный промежуточный продукт. ^[135]

Трансдифференцировка с помощью активатора, опосредованного CRISPR [ править ]

Судьбой клетки можно эффективно управлять путем редактирования эпигенома . В частности, путем прямой активации экспрессии специфических эндогенных генов с помощью активатора, опосредованного CRISPR . Когда dCas9 (который был модифицирован так, что он больше не разрезает ДНК, но все еще может быть направлен к определенным последовательностям и связываться с ними) комбинируется с активаторами транскрипции, он может точно манипулировать экспрессией эндогенных генов. Используя этот метод, Wei et al. Усилили экспрессию эндогенных генов Cdx2 и Gata6 с помощью активаторов, опосредованных CRISPR, таким образом, напрямую преобразовав эмбриональные стволовые клетки мыши в два внезародышевых клона, то есть в типичные стволовые клетки трофобласта и внэмбриональные клетки энтодермы. ^[136] Аналогичный подход был использован для индукции активации эндогенных генов Brn2, Ascl1 и Myt1l для преобразования эмбриональных фибробластов мыши в индуцированные нейрональные клетки. ^[137] Таким образом, активация транскрипции и эпигенетическое ремоделирование эндогенных основных факторов транскрипции достаточны для конверсии между типами клеток. Быстрая и устойчивая активация эндогенных генов в их естественном хроматиновом контексте с помощью этого подхода может облегчить репрограммирование с помощью временных методов, которые избегают геномной интеграции и обеспечивают новую стратегию преодоления эпигенетических барьеров на пути спецификации клеточных судеб.

Поэтапное моделирование процесса регенерации [ править ]

Другой способ перепрограммирования - моделирование процессов, происходящих при регенерации конечностей амфибий . У амфибий urodele ранней стадией регенерации конечностей является дедифференцировка волокон скелетных мышц в клеточные элементы, которые пролиферируют в ткани конечностей. Тем не менее, последовательное лечение малой молекулы мышечного волокна с myoseverin, reversine (The киназа Aurora B ингибитор) и некоторыми другими химические веществ: Bio (гликоген - синтаз-3 ингибитор киназы), лизофосфатидные кислоты (плейотропный активатором G-белком-связанными рецепторов), SB203580 ( ингибитор p38 MAP-киназы ) или SQ22536(ингибитор аденилатциклазы) вызывает образование новых типов мышечных клеток, а также других типов клеток, таких как предшественники жировых клеток, клеток костей и нервной системы. ^[138]

Трансдифференцировка на основе антител [ править ]

Исследователи обнаружили , что GCSF -mimicking антитело может активировать рост-стимулирующего рецептор на мозг клетки таким образом , что индуцирует стволовые клетки костного мозга , которые обычно развиваются в белые кровяные клетки , чтобы стать нервными клетками - предшественников. Методика ^[139] позволяет исследователям искать в больших библиотеках антител и быстро выбирать те, которые обладают желаемым биологическим эффектом. ^{[140] [141] [142]}

Перепрограммирование бактериями [ править ]

Желудочно-кишечный тракт человека заселен огромным сообществом симбионтов и комменсалов. Исследователи демонстрируют феномен репрограммирования соматических клеток бактериями и генерации мультипотенциальных клеток из клеток дермальных фибробластов взрослого человека путем включения молочнокислых бактерий ^[143]. Эта клеточная трансдифференцировка вызывается рибосомами и «может происходить через донорские бактерии, которые проглатываются и перевариваются клетки-хозяева, которые могут вызывать рибосомный стресс и стимулировать пластичность клеточного развития ». ^[144]

Условно перепрограммированные ячейки [ править ]

Шлегель и Лю ^[145] продемонстрировали, что комбинация питающих клеток ^{[146] [147] [148]} и ингибитора киназы Rho (Y-27632) ^{[149] [150]} индуцирует неограниченную пролиферацию нормальных и опухолевых эпителиальных клеток из многих тканей. in vitro. Этот процесс происходит без необходимости трансдукции экзогенных вирусных или клеточных генов. Эти клетки были названы «условно перепрограммированными клетками (CRC)». ^[151]Индукция CRC происходит быстро и является результатом перепрограммирования всей популяции клеток. CRC не экспрессируют высокие уровни белков, характерных для ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (например, Sox2, Oct4, Nanog или Klf4). Эта индукция CRC обратима, и удаление Y-27632 и питателей позволяет клеткам нормально дифференцироваться. ^{[145] [152] [153]} Технология CRC может генерировать 2 × 10 ⁶ клеток за 5–6 дней из биопсии иглы и может генерировать культуры из криоконсервированной ткани и менее чем из четырех жизнеспособных клеток. CRC сохраняют нормальный кариотип и остаются неопухолевыми. Этот метод также позволяет эффективно создавать культуры клеток из опухолей человека и грызунов. ^{[145] [154][155]}

Возможность быстро генерировать множество опухолевых клеток из небольших образцов биопсии и замороженной ткани предоставляет значительные возможности для клеточной диагностики и лечения (включая тестирование на химиочувствительность) и значительно увеличивает ценность биобанков. ^{[145] [154] [155]} Используя технологию CRC, исследователи смогли определить эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли легкого. ^[156] Группа Энглемана ^[157]описывает фармакогеномную платформу, которая способствует быстрому открытию комбинаций лекарств, которые могут преодолеть устойчивость с помощью системы CRC. Кроме того, метод CRC позволяет генетические манипуляции с эпителиальными клетками ex vivo и их последующую оценку in vivo у одного и того же хозяина. В то время как первоначальные исследования показали, что совместное культивирование эпителиальных клеток с клетками Swiss 3T3 J2 необходимо для индукции CRC, при использовании планшетов для культивирования через лунки физический контакт между питающими клетками и эпителиальными клетками не требуется для индукции CRC и, что более важно, необходимо облучение питающих клеток. для этой индукции. В соответствии с экспериментами трансвелл, кондиционированная среда индуцирует и поддерживает CRC, что сопровождается сопутствующим повышением активности клеточной теломеразы.Активность кондиционированной среды напрямую коррелирует с радиационно-индуцированным апоптозом питающих клеток. Таким образом, условное перепрограммирование эпителиальных клеток опосредуется комбинацией Y-27632 и растворимого фактора (ов), высвобождаемого апоптотическими питающими клетками.^[158]

Riegel et al. ^[159]демонстрируют, что мышиные ME клетки, выделенные из нормальных молочных желез или из опухолей молочной железы, индуцированных вирусом опухоли молочной железы мышей (MMTV) -Neu, могут культивироваться бесконечно долго как условно перепрограммированные клетки (CRC). Маркеры, ассоциированные с предшественниками на клеточной поверхности, быстро индуцируются в нормальных ME-CRC мыши по сравнению с ME-клетками. Однако экспрессия определенных субпопуляций предшественников молочной железы, таких как CD49f + ESA + CD44 +, значительно снижается на более поздних пассажах. Тем не менее, мышиные ME-CRCs, выращенные в трехмерном внеклеточном матриксе, дали начало ацинарным структурам молочных желез. ME-CRC, выделенные из опухолей молочной железы трансгенных мышей MMTV-Neu, экспрессируют высокие уровни HER2 / neu, а также маркеры опухолевых клеток, такие как CD44 +, CD49f + и ESA + (EpCam). Эти паттерны экспрессии поддерживаются в более поздних пассажах CRC.У ME-CRC раннего и позднего пассажа из опухолей MMTV-Neu, которые были имплантированы в жировые подушечки молочной железы сингенных или голых мышей, развивались сосудистые опухоли, которые метастазировали в течение 6 недель после трансплантации. Важно отметить, что гистопатология этих опухолей неотличима от гистопатологии родительских опухолей, которые развиваются у мышей MMTV-Neu. Применение системы CRC к эпителиальным клеткам молочной железы мышей обеспечивает привлекательную модельную систему для изучения генетики и фенотипа нормального и трансформированного эпителия мыши в определенной культуральной среде и исследований трансплантата in vivo.Гистопатология этих опухолей была неотличима от гистопатологии родительских опухолей, которые развиваются у мышей MMTV-Neu. Применение системы CRC к эпителиальным клеткам молочной железы мышей обеспечивает привлекательную модельную систему для изучения генетики и фенотипа нормального и трансформированного эпителия мыши в определенной культуральной среде и исследований трансплантата in vivo.гистопатология этих опухолей была неотличима от гистопатологии родительских опухолей, которые развиваются у мышей MMTV-Neu. Применение системы CRC к эпителиальным клеткам молочной железы мышей обеспечивает привлекательную модельную систему для изучения генетики и фенотипа нормального и трансформированного эпителия мыши в определенной культуральной среде и исследований трансплантата in vivo.

Другой подход к CRC заключается в ингибировании CD47 - мембранного белка, который является рецептором тромбоспондина-1 . Потеря CD47 делает возможным устойчивую пролиферацию первичных эндотелиальных клеток мышей , увеличивает асимметричное деление и позволяет этим клеткам спонтанно репрограммироваться с образованием мультипотентных кластеров, подобных эмбриоидным телам. Нокдаун CD47 резко увеличивает уровни мРНК c-Myc и других факторов транскрипции стволовых клеток в клетках in vitro и in vivo. Тромбоспондин-1 является ключевым сигналом окружающей среды, который подавляет самообновление стволовых клеток через CD47. Таким образом, антагонисты CD47 делают возможным самообновление и перепрограммирование клеток, преодолевая негативную регуляцию c-Myc и других факторов транскрипции стволовых клеток.^[160] Блокада CD47 in vivo с использованием антисмыслового морфолино увеличивает выживаемость мышей, подвергшихся летальному облучению всего тела из-за повышенной пролиферативной способности клеток, полученных из костного мозга, и радиозащиты радиочувствительных тканей желудочно-кишечного тракта. ^[161]

Специфические энхансеры [ править ]

Дифференцированные макрофаги могут самообновляться в тканях и длительно разрастаться в культуре. ^[27] При определенных условиях макрофаги могут делиться, не теряя свойств, которые они приобрели, специализируясь на иммунных клетках, что обычно невозможно с дифференцированными клетками . Макрофаги достигают этого путем активации генной сети, подобной той, что обнаружена в эмбриональных стволовых клетках. Анализ отдельных клеток показал, что in vivo пролиферирующие макрофаги могут подавлять репертуар специфичных для макрофагов энхансеров, связанных с генной сетью, контролирующей самообновление. Это произошло, когда концентрации двух факторов транскрипции, названных MafBи c-Maf были естественно низкими или были подавлены на короткое время. Генетические манипуляции, которые отключили MafB и c-Maf в макрофагах, заставили клетки запустить программу самообновления. Подобная сеть также контролирует самообновление эмбриональных стволовых клеток, но связана с отдельными энхансерами, специфичными для эмбриональных стволовых клеток. ^[28]

Следовательно, макрофаги, изолированные от мышей с дефицитом MafB- и c-Maf-double, делятся бесконечно; самообновление зависит от c-Myc и Klf4 . ^[162]

Косвенное преобразование родословной [ править ]

Непрямая конверсия клонов - это методология перепрограммирования, при которой соматические клетки переходят через пластичное промежуточное состояние частично перепрограммированных клеток (пре-ИПСК), индуцируемое кратковременным воздействием факторов репрограммирования с последующей дифференцировкой в ​​специально разработанной химической среде (искусственная ниша). ^[163]

Этот метод может быть как более эффективным, так и более безопасным, поскольку он не вызывает опухолей или других нежелательных генетических изменений и дает гораздо больший результат, чем другие методы. Однако безопасность этих клеток остается под вопросом. Поскольку преобразование клонов из пре-iPSC зависит от использования условий репрограммирования iPSC, часть клеток может приобретать плюрипотентные свойства, если они не останавливают процесс де-дифференцировки in vitro или из-за дальнейшей де-дифференцировки in vivo. ^[164]

Гликопротеин внешней мембраны [ править ]

Общей чертой плюрипотентных стволовых клеток является специфический характер гликозилирования белков их внешней мембраны. Это отличает их от большинства неплюрипотентных клеток, но не от лейкоцитов . ^[165] В гликаны поэтому на стволовой клеточной поверхности быстро реагировать на изменения в клеточном состоянии и сигнализации и идеально подходят для выявления даже незначительных изменений в клеточных популяциях. Многие маркеры стволовых клеток основаны на гликановых эпитопах клеточной поверхности, включая широко используемые маркеры SSEA-3 , SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81. ^[166] Suila Heli et al. ^[167]предполагают, что в стволовых клетках человека внеклеточный O-GlcNAc и внеклеточный O-LacNAc играют решающую роль в тонкой настройке сигнального пути Notch - высококонсервативной клеточной сигнальной системы, которая регулирует спецификацию клеточной судьбы, дифференциацию, лево-правую асимметрию, апоптоз. , сомитогенез, ангиогенез и играет ключевую роль в пролиферации стволовых клеток (обзор Perdigoto и Bardin ^[168] и Jafar-Nejad et al. ^[169] )

Изменения гликозилирования белков внешней мембраны являются маркерами состояний клеток, так или иначе связанных с плюрипотентностью и дифференцировкой. ^[170] Изменение гликозилирования, по-видимому, не только результат инициализации экспрессии гена, но и выступает в качестве важного регулятора гена, участвующего в приобретении и поддержании недифференцированного состояния. ^[171]

Например, активация гликопротеина АСА, ^[172] связывая glycosylphosphatidylinositol на поверхности клеток - предшественников в периферической крови человека, индуцирует повышенную экспрессию генов Wnt , Notch-1 , Bmi1 и НОХВ4 через сигнальный каскад PI3K / Akt / MTOR / PTEN и способствует образованию самообновляющейся популяции гемопоэтических стволовых клеток. ^[173]

Кроме того, дедифференцировка клеток-предшественников, индуцированная ACA-зависимым сигнальным путем, приводит к ACA-индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам, способным дифференцироваться in vitro в клетки всех трех зародышевых листков . ^[174] Изучение способности лектинов поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека привело к открытию лектина Erythrina crista-galli (ECA), который может служить простой и высокоэффективной матрицей для культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека. клетки. ^[175]

Перепрограммирование с помощью протеогликана [ править ]

Альтернативной стратегией преобразования соматических клеток в плюрипотентные состояния может быть непрерывная стимуляция фибробластов одним протеогликаном ЕСМ , фибромодулином . ^[176] Такие клетки демонстрируют способность к регенерации скелетных мышц с заметно меньшим канцерогенным риском по сравнению с ИПСК. ^[177] Снижение онкогенности таких клеток связано с активацией CDKN2B во время процесса репрограммирования рекомбинантного человеческого фибромодулина ^[178]

Перепрограммирование с помощью физического подхода [ править ]

Белок клеточной адгезии Е-кадгерин незаменим для устойчивого плюрипотентного фенотипа . ^[179] Во время перепрограммирования для генерации iPS-клеток N-кадгерин может заменять функцию E-кадгерина. ^[180] Эти функции кадгеринов не связаны напрямую с адгезией, поскольку морфология сфер помогает поддерживать «стволовость» стволовых клеток. ^[181] Более того, образование сфер из-за принудительного роста клеток на низкой поверхности прикрепления иногда вызывает репрограммирование. Например, клетки-предшественники нейронов могут быть получены из фибробластов непосредственно с помощью физического подхода без введения экзогенных факторов репрограммирования.

Физические сигналы в виде параллельных микроканавок на поверхности клеточно-адгезионных субстратов могут заменить эффекты низкомолекулярных эпигенетических модификаторов и значительно повысить эффективность репрограммирования. Механизм основан на механомодуляции эпигенетического состояния клеток. В частности, «снижение активности гистон-деацетилазы и усиление экспрессии домена 5 повторов WD (WDR5) - субъединицы H3-метилтранферазы - на поверхности с микроканавками приводит к усилению ацетилирования и метилирования гистона H3». Нанофиброзные каркасы с выровненной ориентацией волокон производят эффекты, аналогичные тем, которые производятся микроканавками, предполагая, что изменения в морфологии клеток могут быть ответственны за модуляцию эпигенетического состояния. ^[182]

Жесткость субстрата - важный биофизический сигнал, влияющий на нейронную индукцию и спецификацию подтипа. Например, мягкие субстраты способствуют нейроэпителиальному преобразованию, ингибируя дифференцировку hESC в нервном гребне зависимым от BMP4 образом. Механистические исследования выявили многоцелевой механотрансдуктивный процесс, включающий механочувствительное фосфорилирование Smad и перемещение нуклеоцитоплазмы, регулируемое зависимыми от жесткости активностями Hippo / YAP, а также целостностью и сократимостью актомиозинового цитоскелета . ^[183]

Эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) подвергаются самообновлению в присутствии цитокинового фактора ингибирования лейкемии (LIF). После удаления LIF, mESCs дифференцируются, что сопровождается увеличением адгезии клетка-субстрат и размножением клеток. Ограниченное распространение клеток в отсутствие LIF либо путем культивирования mESCs на химически определенных, слабо адгезивных биосубстратах, либо путем манипулирования цитоскелетом позволяло клеткам оставаться в недифференцированном и плюрипотентном состоянии. Эффект ограниченного распространения клеток на самообновление mESC не опосредован увеличением межклеточной адгезии, поскольку ингибирование адгезии mESC с использованием функции, блокирующей антитело против E-кадгерина или siRNA , не способствует дифференцировке.^[184] Были описаны возможные механизмы предопределения судьбы стволовых клеток посредством физических взаимодействий с внеклеточным матриксом. ^{[185] [186]}

Был разработан новый метод, который быстрее и эффективнее превращает клетки в стволовые клетки, «сжимая» их, используя жесткость трехмерного микросреда и плотность окружающего геля. Этот метод может быть применен к большому количеству клеток для производства стволовых клеток для медицинских целей в промышленных масштабах. ^{[187] [188] [189]}

Клетки, участвующие в процессе репрограммирования, изменяются морфологически по мере развития процесса. Это приводит к физическим различиям в силах сцепления между клетками. Существенные различия в «клеевой подписи» между плюрипотентными стволовыми клетками, частично перепрограммированными клетками, дифференцированным потомством и соматическими клетками позволили разработать процесс разделения для выделения плюрипотентных стволовых клеток в микрожидкостных устройствах , ^[190] , который является:

1. быстро (разделение занимает менее 10 минут);
2. эффективный (в результате разделения получается культура клеток iPS с чистотой более 95%);
3. безвредны (выживаемость клеток превышает 80 процентов, и полученные клетки сохраняют нормальные профили транскрипции, потенциал дифференцировки и кариотип).

Стволовые клетки обладают механической памятью (они помнят прошлые физические сигналы) - с факторами сигнального пути Hippo : ^[191] Да-ассоциированный белок (YAP) и коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим доменом (TAZ), действующим как внутриклеточный механический реостат, который хранит информация из прошлых физических сред и влияет на судьбу клеток. ^{[192] [193]}

Нервные стволовые клетки [ править ]

Инсульт и многие нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, нуждаются в клеточной заместительной терапии. Успешное использование преобразованных нервных клеток (CN) в трансплантации открывает новые возможности для лечения таких заболеваний. ^[194] Тем не менее, индуцированные нейроны (iNs), непосредственно преобразованные из фибробластов, окончательно коммитированы и демонстрируют очень ограниченную пролиферативную способность, которая может не обеспечивать достаточное количество аутологичных донорских клеток для трансплантации. ^[195] Самовозобновляющиеся индуцированные нейральные стволовые клетки (iNSC) обеспечивают дополнительные преимущества перед iN как для фундаментальных исследований, так и для клинического применения. ^{[125] [126] [127] [196] [197]}

Например, при определенных условиях роста фибробласты мыши можно перепрограммировать с помощью одного фактора, Sox2, для образования iNSC, которые самообновляются в культуре и после трансплантации могут выживать и интегрироваться без образования опухолей в мозге мышей. ^[198] INSC могут быть получены из фибробластов взрослого человека невирусными методами, что позволяет предложить безопасный метод аутологичной трансплантации или разработки моделей заболеваний на основе клеток. ^[197]

Нейронно-химически индуцированные клетки-предшественники (ciNPC) могут быть получены из фибробластов кончика хвоста мыши и соматических клеток мочевыводящих путей человека без введения экзогенных факторов, но - с помощью химического коктейля, а именно VCR (V, VPA , ингибитор HDAC ; C, CHIR99021, ингибитор GSK-3 - киназ и R, RepSox , ингибитор TGF беты - сигнальные пути ), в физиологических гипоксических условиях . ^[199] Альтернативные коктейли с ингибиторами деацетилирования гистонов, киназы гликогенсинтазы и путей TGF-β (где: бутират натрия (NaB) или трихостатин A (TSA) могут заменить VPA, хлорид лития(LiCl) или карбонат лития (Li2CO3) могут заменить CHIR99021, или Repsox может быть заменен SB-431542 или Траниластом ) демонстрируют аналогичную эффективность для индукции ciNPC. ^[199] Zhang и др. ^[200] также сообщают о высокоэффективном репрограммировании фибробластов мыши в индуцированные нейральные стволовые клетки, подобные клеткам (ciNSLC), с использованием смеси из девяти компонентов.

Описаны многочисленные методы прямой трансформации соматических клеток в индуцированные нейральные стволовые клетки. ^[201]

Доказательство принципиальных экспериментов демонстрирует, что возможно преобразовать трансплантированные человеческие фибробласты и человеческие астроциты непосредственно в головном мозге, которые сконструированы для экспрессии индуцибельных форм нейронных генов репрограммирования, в нейроны, когда репрограммирующие гены ( Ascl1 , Brn2a и Myt1l ) активируются после трансплантации употребляя наркотик. ^[202]

Астроциты - наиболее распространенные нейроглиальные клетки головного мозга, которые способствуют образованию рубцов в ответ на травму - могут быть напрямую перепрограммированы in vivo, чтобы стать функциональными нейронами, которые формируют сети у мышей, без необходимости трансплантации клеток. ^[203] Исследователи наблюдали за мышами в течение почти года, чтобы найти признаки образования опухоли, и не обнаружили их. Те же исследователи превратили астроциты, образующие рубцы, в клетки-предшественники, называемые нейробластами, которые регенерировали в нейроны в поврежденном спинном мозге взрослого человека. ^[204]

Клетки-предшественники олигодендроцитов [ править ]

Без миелина, изолирующего нейроны, нервные сигналы быстро теряют силу. Заболевания, поражающие миелин, такие как рассеянный склероз, приводят к появлению нервных сигналов, которые не могут распространяться на нервные окончания, и, как следствие, приводят к когнитивным, моторным и сенсорным проблемам. Трансплантация клеток- предшественников олигодендроцитов (OPC), которые могут успешно создавать миелиновые оболочки вокруг нервных клеток, является многообещающим потенциальным терапевтическим ответом. Прямое клональное преобразование фибробластов мыши и крысы в ​​олигодендроглиальные клетки обеспечивает потенциальный источник OPCs. Конверсия путем принудительной экспрессии восьми ^[205] или трех ^[206] факторов транскрипции Sox10, Olig2 и Zfp536 может предоставить такие клетки.

Кардиомиоциты [ править ]

Клеточная терапия in vivo может обеспечить трансформирующий подход для увеличения роста сосудов и мышц и предотвращения образования неконтрактильных рубцов путем доставки факторов транскрипции ^[122] или микроРНК ^[14] в сердце. ^[207] Сердечные фибробласты, которые составляют 50% клеток в сердце млекопитающих, могут быть перепрограммированы в кардиомиоцитоподобные клетки in vivo путем локальной доставки основных факторов транскрипции сердца (GATA4, MEF2C, TBX5 и для улучшенного перепрограммирования плюс ESRRG, MESP1 , Myocardin и ZFPM2) после коронарного лигирования . ^{[122] [208]}Эти результаты касались методов лечения, которые могут напрямую ремускуляризовать сердце без трансплантации клеток. Однако эффективность такого репрограммирования оказалась очень низкой, а фенотип полученных кардиомиоцитоподобных клеток не похож на фенотип зрелого нормального кардиомиоцита. Кроме того, трансплантация факторов сердечной транскрипции в поврежденное сердце мыши приводила к плохой выживаемости клеток и минимальной экспрессии сердечных генов. ^[209]

Между тем произошел прогресс в методах получения сердечных миоцитов in vitro. ^{[210] [211]} Эффективная сердечная дифференцировка iPS-клеток человека привела к образованию клеток-предшественников, которые оставались в инфарктных сердцах крыс, и уменьшила ремоделирование сердца после ишемического повреждения. ^[212]

Команда ученых под руководством Шэн Дина использовала коктейль из девяти химикатов (9C) для трансдифференцировки клеток кожи человека в бьющиеся клетки сердца. При использовании этого метода более 97% клеток начали биться, что характерно для полностью развитых здоровых сердечных клеток. Химически индуцированные кардиомиоцитоподобные клетки (ciCM) равномерно сокращались и напоминали человеческие кардиомиоциты по своим транскриптомным, эпигенетическим и электрофизиологическим свойствам. При трансплантации в сердца мышей, подвергшихся инфаркту, обработанные 9C фибробласты эффективно превращались в ciCM и развивались в здоровые на вид клетки сердечной мышцы внутри органа. ^[213] Этот подход химического перепрограммирования после дальнейшей оптимизации может предложить простой способ предоставить сигналы, которые побуждают сердечную мышцу к локальной регенерации. ^[214]

В другом исследовании ишемическая кардиомиопатия на модели инфаркта мышей была нацелена на трансплантацию iPS-клеток. Он синхронизирует отказавшие желудочки, предлагая регенеративную стратегию для достижения ресинхронизации и защиты от декомпенсации за счет улучшения проводимости и сократимости левого желудочка, уменьшения рубцевания и отмены структурного ремоделирования. ^[215] Один протокол генерировал популяции до 98% кардиомиоцитов из hPSCs просто путем модуляции канонического пути передачи сигнала Wnt в определенные моменты времени во время дифференцировки с использованием легкодоступных низкомолекулярных соединений. ^[216]

Открытие механизмов, контролирующих образование кардиомиоцитов, привело к разработке препарата ITD-1, который эффективно очищает клеточную поверхность от рецептора TGF-β типа II и избирательно ингибирует внутриклеточную передачу сигналов TGF-β. Таким образом, он избирательно усиливает дифференцировку незарегистрированной мезодермы в кардиомиоциты, но не в гладкие мышцы сосудов и эндотелиальные клетки. ^[217]

В рамках одного проекта были засеяны децеллюляризованные сердца мыши мультипотенциальными клетками-предшественниками сердечно-сосудистой системы, производными от ИПСК человека. Введенные клетки мигрировали, пролиферировали и дифференцировались in situ в кардиомиоциты, клетки гладкой мускулатуры и эндотелиальные клетки, чтобы реконструировать сердца. Кроме того, внеклеточный матрикс сердца (субстрат сердечного каркаса) дал сигнал клеткам человека стать специализированными клетками, необходимыми для правильной работы сердца. После 20 дней перфузии факторами роста сконструированные ткани сердца снова начали биться и стали реагировать на лекарства. ^[218]

Репрограммирование сердечных фибробластов в индуцированные кардиомиоцитоподобные клетки (iCM) in situ представляет собой многообещающую стратегию регенерации сердца. Мыши подвергались in vivo воздействию трех факторов сердечной транскрипции GMT (Gata4, Mef2c, Tbx5) и малых молекул: SB-431542 ( ингибитор трансформирующего фактора роста (TGF) -β) и XAV939 (ингибитор WNT) в течение 2 недель. после инфаркта миокарда показали значительно улучшенное репрограммирование (эффективность перепрограммирования увеличилась в восемь раз) и сердечную функцию по сравнению с теми, кто подвергался воздействию только GMT. ^[219]

См. Также: обзор ^[220]

Омоложение мышечных стволовых клеток [ править ]

Пожилые люди часто страдают от прогрессирующей мышечной слабости и регенеративной недостаточности, отчасти из-за повышенной активности митоген-активируемых киназных путей p38α и p38β в стареющих стволовых клетках скелетных мышц. Подвергая такие стволовые клетки временному ингибированию p38α и p38β в сочетании с культивированием на мягких гидрогелевых субстратах, они быстро размножаются и омолаживаются, что приводит к возвращению их силы. ^[221]

У гериатрических мышей покоящиеся сателлитные клетки теряют обратимое состояние покоя, переходя в необратимое состояние предварительного старения, вызванное дерепрессией p16 INK4a (также называемого Cdkn2a). При травме эти клетки не активируются и не расширяются даже в молодой среде. Подавление p16INK4a в гериатрических сателлитных клетках восстанавливает покой и регенеративные функции мышц. ^[222]

Миогенные предшественники для потенциального использования при моделировании заболеваний или клеточной терапии, нацеленной на скелетные мышцы, также могут быть получены непосредственно из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием свободно плавающей сферической культуры (сфер EZ) в культуральной среде с добавлением высоких концентраций (100 нг / мл) фактора роста фибробластов-2 ( FGF-2 ) и фактора роста эпидермиса . ^[223]

Гепатоциты [ править ]

В отличие от существующих протоколов получения гепатоцитов из фибробластов человека, Saiyong Zhu et al., (2014) ^[224] не генерировали ИПСК, но, используя небольшие молекулы, сокращали репрограммирование до плюрипотентности для создания индуцированного состояния мультипотентных клеток-предшественников (iMPC), из которого клетки-предшественники энтодермы и впоследствии гепатоциты (iMPC-Heps) эффективно дифференцировались. После трансплантации иммунодефицитной мышиной модели печеночной недостаточности человека iMPC-Heps интенсивно пролиферировал и приобрел уровни функции гепатоцитов, аналогичные таковым у первичных взрослых гепатоцитов человека. iMPC-Heps не образовывал опухолей, скорее всего, потому, что они никогда не переходили в плюрипотентное состояние.

Эти результаты устанавливают возможность значительной репопуляции печени мышей с человеческими гепатоцитами, созданными in vitro, что устраняет давние препятствия на пути к терапии аутологичными клетками печени.

Коктейль из малых молекул, Y-27632 , A-83-01 (ингибитор киназы / рецептора активина TGFβ, подобный киназе ( ALK5 )) и CHIR99021 (мощный ингибитор GSK-3 ), может преобразовывать зрелые гепатоциты крысы и мыши in vitro в пролиферативные бипотентные клетки - CLiP (химически индуцированные предшественники печени). CLiP могут дифференцироваться как в зрелые гепатоциты, так и в билиарные эпителиальные клетки, которые могут образовывать функциональные протоковые структуры. При длительном культивировании CLiP не утратили своей пролиферативной способности и способности к дифференцировке в печени и могут повторно заселять хронически поврежденную ткань печени. ^[225]

Клетки, продуцирующие инсулин [ править ]

Осложнения сахарного диабета, такие как сердечно-сосудистые заболевания , ретинопатия , невропатия , нефропатия и заболевания периферического кровообращения, зависят от нарушения регуляции сахара из-за недостатка инсулина в бета-клетках поджелудочной железы и могут быть летальными, если их не лечить. Одним из многообещающих подходов к пониманию и лечению диабета является использование плюрипотентных стволовых клеток (PSC), включая эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные PCS (iPSC). ^[226] К сожалению, инсулин-экспрессирующие клетки, производные от PSC человека, больше напоминают β-клетки плода человека, чем β-клетки взрослых. В отличие от взрослого -клеток, фетальные клетки бета - видимому , функционально незрелых, как показано повышением базальной глюкозы секреции и отсутствие стимуляции глюкозой и подтверждается Секвенирование РНК из которого транскриптов . ^[227]

Альтернативной стратегией является превращение фибробластов в разные популяции энтодермальных клеток-предшественников и, используя смесь сигнальных факторов, успешную дифференцировку этих энтодермальных клеток-предшественников в функциональные бета-подобные клетки как in vitro, так и in vivo. ^[228]

Сверхэкспрессия трех факторов транскрипции , PDX1 (необходимого для разрастания зачатка поджелудочной железы и созревания бета-клеток), NGN3 (необходимого для образования эндокринных клеток-предшественников) и комбинации MAFA (для созревания бета-клеток) (называемой PNM) может привести к трансформации некоторые типы клеток переходят в состояние, подобное бета-клеткам. ^[229] Доступным и обильным источником функциональных клеток, продуцирующих инсулин, является кишечник . Экспрессия PMN в кишечных органоидах человека стимулирует превращение кишечных эпителиальных клеток в β-подобные клетки, возможно, приемлемые для трансплантации . ^[230]

Прародители Нефрона [ править ]

Взрослые клетки проксимальных канальцев были непосредственно транскрипционно перепрограммированы в предшественники нефронов эмбриональной почки с использованием пула из шести генов инструктивных факторов транскрипции (SIX1, SIX2, OSR1, гомолог 1 глаз отсутствует (EYA1), гомолог 1 улитки (HOXA11) и гомолог улитки 2). (SNAI2)), которые активировали гены, соответствующие фенотипу предшественника кэп- мезенхимы / нефрона в клеточной линии проксимальных канальцев взрослых. ^[231] Генерация таких клеток может привести к клеточной терапии почечной недостаточности у взрослых . Органоиды эмбриональных почек, помещенные в почки взрослых крыс, могут подвергаться дальнейшему развитию и развитию сосудов. ^[232]

Клетки кровеносных сосудов [ править ]

По мере старения кровеносных сосудов они часто становятся ненормальными по структуре и функциям, что способствует возникновению множества возрастных заболеваний, включая инфаркт миокарда, ишемический инсульт и атеросклероз артерий, кровоснабжающих сердце, мозг и нижние конечности. Итак, важная цель - стимулировать рост сосудов для коллатерального кровообращения, чтобы предотвратить обострение этих заболеваний. Индуцированные сосудистые клетки-предшественники (iVPC) полезны для клеточной терапии, предназначенной для стимуляции роста коронарных коллатералей. Они были созданы путем частичного перепрограммирования эндотелиальных клеток. ^[163]Сосудистая приверженность iVPCs связана с эпигенетической памятью эндотелиальных клеток, которая порождает их как клеточные компоненты растущих кровеносных сосудов. Вот почему, когда iVPC были имплантированы в миокард , они прижились в кровеносных сосудах и увеличили коронарный коллатеральный кровоток лучше, чем iPSC, мезенхимальные стволовые клетки или нативные эндотелиальные клетки. ^[233]

Генетическая модификация ex vivo может быть эффективной стратегией усиления функции стволовых клеток. Например, клеточная терапия с использованием генетической модификации киназой Pim-1 (нижестоящий эффектор Akt , который положительно регулирует неоваскулогенез) клеток, производных от костного мозга ^[234] или клеток-предшественников сердца человека, выделенных из поврежденного миокарда ^[235], приводит к долговечности восстановления, вместе с улучшением функциональных показателей гемодинамики миокарда.

Стволовые клетки, извлеченные из жировой ткани после липосакции, могут стать предшественниками гладкомышечных клеток (iPVSMC), обнаруженных в артериях и венах. ^[236]

Система 2D-культивирования iPS-клеток человека ^[237] в сочетании с тройной маркерной селекцией ( CD34 (поверхностный гликофосфопротеин, экспрессируемый на эмбриональных фибробластах ранних стадий развития), NP1 (рецептор - нейропилин 1) и KDR (рецептор, содержащий домен киназной вставки)) для Выделение васкулогенных клеток-предшественников из ИПСК человека привело к образованию эндотелиальных клеток, которые после трансплантации образовали стабильные функциональные кровеносные сосуды мыши in vivo, сохраняющиеся в течение 280 дней. ^[238]

Для лечения инфаркта важно предотвратить образование фиброзной рубцовой ткани. Этого можно достичь in vivo путем временного применения паракринных факторов, которые перенаправляют вклад нативных стволовых клеток-предшественников сердца из рубцовой ткани в сердечно-сосудистую ткань. Например, в модели инфаркта миокарда у мышей однократная внутримиокардиальная инъекция мРНК фактора роста эндотелия сосудов человека A (VEGF-A modRNA), модифицированная для выхода из нормальной системы защиты организма, приводит к долгосрочному улучшению функции сердца за счет мобилизации. и перенаправление клеток-предшественников эпикарда на типы клеток сердечно-сосудистой системы. ^[239]

Стволовые клетки крови [ править ]

Красные кровяные тельца [ править ]

Переливание эритроцитов необходимо многим пациентам. Однако на сегодняшний день предложение эритроцитов остается нестабильным. Кроме того, при переливании существует риск передачи инфекционных заболеваний. Большой запас безопасных эритроцитов, созданных in vitro, поможет решить эту проблему. Генерация эритроидных клеток ex vivo может обеспечить альтернативные продукты для переливания крови для удовлетворения настоящих и будущих клинических требований. ^{[240] [241]} Красные кровяные тельца (RBC), полученные in vitro из мобилизованных CD34- положительных клеток, имеют нормальную выживаемость при переливании аутологичному реципиенту. ^[242] Эритроциты, полученные in vitro, содержали исключительно гемоглобин плода.(HbF), который восстанавливает функциональность этих эритроцитов. In vivo переключение эмбрионального гемоглобина на взрослый наблюдалось после инфузии ядерных предшественников эритроидных клеток, полученных из ИПСК. ^[243] Хотя эритроциты не имеют ядер и, следовательно, не могут образовывать опухоль, их непосредственные предшественники эритробластов имеют ядра. Окончательное созревание эритробластов в функциональные эритроциты требует сложного процесса ремоделирования, который заканчивается экструзией ядра и образованием энуклеированных эритроцитов. ^[244] Репрограммирование клеток часто нарушает энуклеацию. Переливание эритроцитов или эритробластов, созданных in vitro, недостаточно защищает от опухолевого образования.

Арил углеводородного рецептора (AHR) путь (который , как было показано, участвует в содействии развитию рака клеток) играет важную роль в нормальном развитии клеток крови. Активация AhR в гематопоэтических клетках-предшественниках (HP) вызывает беспрецедентную экспансию HP, мегакариоцитарных и эритроидных клеток. ^[245] См. Также Краткий обзор: ^{[246] [247]} Ген SH2B3 кодирует негативный регулятор передачи сигналов цитокинов, и встречающиеся в природе варианты с потерей функции в этом гене увеличивают количество эритроцитов in vivo. Направленное подавление SH2B3 в первичных гемопоэтических стволовых клетках человека и клетках-предшественниках увеличивало созревание и общий выход эритроцитов, полученных in vitro. Более того, инактивация SH2B3 посредствомРедактирование генома CRISPR / Cas9 в плюрипотентных стволовых клетках человека позволило увеличить экспансию эритроидных клеток с сохраненной дифференцировкой. ^[248] (См. Также обзор. ^{[247] [249]} )

Тромбоциты [ править ]

Тромбоциты помогают предотвратить кровоизлияние в тромбоцитопенических пациентах и пациентах с тромбоцитемия . Существенной проблемой для пациентов с множественными переливаниями крови является невосприимчивость к переливаниям тромбоцитов. Таким образом, способность генерировать продукты тромбоцитов ex vivo и продукты тромбоцитов, лишенные антигенов HLA, в бессывороточной среде будет иметь клиническое значение. В механизме, основанном на РНК-интерференции, использовался лентивирусный вектор для экспрессии короткой шпилечной РНКи, нацеленной на транскрипты β2-микроглобулина в CD34-положительных клетках. Генерированные тромбоциты продемонстрировали снижение антигенов HLA класса I на 85%. Эти тромбоциты, как оказалось, нормально функционировали in vitro ^{[250] [251]}

Одна клинически применимая стратегия получения функциональных тромбоцитов из ИПСК человека включает создание стабильных иммортализованных линий клеток-предшественников мегакариоцитов (imMKCL) посредством доксициклин- зависимой сверхэкспрессии BMI1 и BCL-XL . Полученные imMKCL могут быть увеличены в культуре в течение продолжительных периодов времени (4–5 месяцев), даже после криоконсервации . Прекращение сверхэкспрессии (путем удаления доксициклина из среды) c-MYC, BMI1 и BCL-XL в растущих imMKCLs привело к продукции тромбоцитов CD42b + с функциональностью, сопоставимой с функциональностью нативных тромбоцитов на основе ряда анализов. in vitro и in vivo. ^[252]Thomas et al. Описывают стратегию прямого программирования, основанную на одновременной экзогенной экспрессии 3 факторов транскрипции: GATA1 , FLI1 и TAL1 . Запрограммированные вперед мегакариоциты пролиферируют и дифференцируются в культуре в течение нескольких месяцев с чистотой мегакариоцитов более 90%, достигая до 2х10 ⁵ зрелых мегакариоцитов на входной hPSC. Функциональные тромбоциты генерируются по всей культуре, что позволяет предполагать сбор нескольких единиц трансфузии от всего лишь одного миллиона исходных hPSC. ^[253] См. Также обзор ^[254]

Иммунные клетки [ править ]

Специализированный тип лейкоцитов , известный как цитотоксические Т- лимфоциты (ЦТЛ), вырабатываются иммунной системой и способны распознавать специфические маркеры на поверхности различных инфекционных или опухолевых клеток, заставляя их начать атаку, чтобы убить вредные клетки. клетки. Таким образом, иммунотерапия функциональными антиген-специфическими Т-клетками имеет потенциал в качестве терапевтической стратегии для борьбы со многими видами рака и вирусных инфекций. ^[255] Однако источники клеток ограничены, потому что они производятся в небольших количествах естественным путем и имеют короткий срок службы.

Потенциально эффективным подходом к созданию антиген-специфичных CTL является превращение зрелых иммунных Т-клеток в ИПСК, которые обладают неопределенной пролиферативной способностью in vitro и после их размножения, чтобы заставить их повторно дифференцироваться обратно в Т-клетки. ^{[256] [257] [258]}

Другой метод сочетает технологии ИПСК и химерного антигенного рецептора (CAR) ^[259] для создания человеческих Т-клеток, нацеленных на CD19 , антиген, экспрессируемый злокачественными В-клетками , в культуре ткани. ^[260] Такой подход к созданию терапевтических Т-клеток человека может быть полезен для иммунотерапии рака и других медицинских приложений.

Инвариантные естественные Т-киллеры (iNKT) обладают большим клиническим потенциалом в качестве адъювантов для иммунотерапии рака. Клетки iNKT действуют как врожденные Т-лимфоциты и служат мостом между врожденной и приобретенной иммунными системами . Они усиливают противоопухолевые ответы, продуцируя гамма- интерферон (IFN-γ). ^[261] Метод сбора, перепрограммирования / дедифференцировки, повторной дифференцировки и инъекции был предложен для лечения связанных опухолей. ^[262]

Дендритные клетки (ДК) специализируются на контроле Т-клеточных ответов. DC с соответствующими генетическими модификациями могут выжить достаточно долго, чтобы стимулировать антиген-специфические CTL, а после этого полностью элиминироваться. DC-подобные антигенпрезентирующие клетки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, могут служить источником вакцинационной терапии. ^[263]

CCAAT / связывающий энхансер белок-α (C / EBPα) индуцирует трансдифференцировку B-клеток в макрофаги с высокой эффективностью ^[264] и усиливает репрограммирование в iPS-клетки при совместной экспрессии с факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и Myc. ^[265] со 100-кратным увеличением эффективности репрограммирования iPS-клеток, охватывающим 95% популяции. ^[266] Кроме того, C / EBPa может с высокой эффективностью превращать выбранные линии клеток В-клеточной лимфомы и лейкемии человека в макрофагоподобные клетки, нарушая способность клеток образовывать опухоли. ^[267]

Омоложение эпителиальных клеток тимуса [ править ]

Тимус является первым органом ухудшаться по мере старения людей. Это сокращение - одна из основных причин, по которой иммунная система с возрастом становится менее эффективной. Сниженная экспрессия фактора транскрипции эпителиальных клеток тимуса FOXN1 участвует как компонент механизма, регулирующего возрастную инволюцию. ^{[268] [269]}

Клэр Блэкберн и его коллеги показывают, что установившуюся возрастную инволюцию тимуса можно обратить вспять принудительной активацией только одного фактора транскрипции - FOXN1 в эпителиальных клетках тимуса, чтобы способствовать омоложению , пролиферации и дифференцировке этих клеток в полностью функциональный эпителий тимуса. ^[270] Это омоложению и увеличение пролиферации сопровождались усилением активности генов , которые способствуют клеточному циклу прогрессии ( циклин D1 , Ап р63 , FgfR2IIIb ) и которые необходимы в тимусе эпителиальных клеток способствовать специфические аспектам Т - клеточного развития ( Dll4 , Kitl ,Ccl25 , Cxcl12 , Cd40 , Cd80 , Ctsl , Pax1 ). В будущем этот метод может широко использоваться для усиления иммунной функции и борьбы с воспалением у пациентов путем омоложения тимуса in situ . ^[271]

Мезенхимальные стволовые клетки [ править ]

Индукция [ править ]

Мезенхимальные стволовые / стромальные клетки (МСК) изучаются для применения в восстановлении сердца, почек, нервов, суставов и костей, а также при воспалительных заболеваниях и гемопоэтической котрансплантации. ^[272] Это связано с их иммуносупрессивными свойствами и способностью дифференцироваться в широкий спектр тканей мезенхимального происхождения. МСК обычно получают из костного мозга или жира взрослых, но они требуют болезненных инвазивных процедур и являются низкочастотными источниками, составляя всего 0,001–0,01% клеток костного мозга и 0,05% липосакционных аспиратов. ^[273] Что касается аутологичного использования, особенно у пожилых людей, наиболее нуждающихся в восстановлении тканей, МСК с возрастом уменьшаются в количестве и качестве. ^{[272] [274] [275]}

IPSC можно было получить путем омоложения клеток даже долгожителей. ^{[9] [41]} Поскольку ИПСК можно собирать без этических ограничений, а культуру можно бесконечно расширять, они являются выгодным источником МСК. ^[276] Обработка IPSC SB-431542 приводит к быстрой и однородной генерации МСК из ИПСК человека. (SB-четыреста тридцать одна тысяча пятьсот сорок два является ингибитором активин / TGF - пути , путем блокирования фосфорилирования из ALK4 , ALK5 и ALK7Эти иПС-МСК могут не обладать способностью к образованию тератом, иметь нормальный стабильный кариотип в культуре и проявлять характеристики роста и дифференцировки, которые очень похожи на характеристики первичных МСК. Он имеет потенциал для увеличения масштабов in vitro, что позволяет использовать терапию на основе МСК. ^[277] МСК, полученные из ИПСК, обладают способностью способствовать регенерации пародонта и являются многообещающим источником легкодоступных стволовых клеток для использования в клиническом лечении пародонтита. ^{[278] [279]}

Lai et al. И Lu сообщают о химическом методе создания MSC-подобных клеток (iMSC) из первичных дермальных фибробластов человека с использованием шести химических ингибиторов (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 и CHIR99021) с 3 факторы роста (трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор ингибирования лейкемии (LIF)). Химический коктейль напрямую преобразует человеческие фибробласты в iMSC в монослойной культуре за 6 дней, и степень конверсии составила примерно 38%. ^[280]

Помимо клеточной терапии in vivo, культура мезенхимальных стволовых клеток человека может использоваться in vitro для массового производства экзосом , которые являются идеальными носителями для доставки лекарств. ^[281]

Дедифференцированные адипоциты [ править ]

Жировая ткань из-за ее обилия и относительно менее инвазивных методов сбора, представляет собой источник мезенхимальных стволовых клеток (МСК). К сожалению, аспираты липосакции содержат только 0,05% МСК. ^[273] Однако, большое количество зрелых адипоцитов, которые в целом потеряли свои пролиферативные способности и , следовательно , как правило , выбрасывают, может быть легко выделено из жировой ткани клеточной суспензии и дедифференцированный в липидном свободном от фибробластоподобных клеток, названного дедифференцированном жира ( DFAT) ячеек. Клетки DFAT восстанавливают способность к активной пролиферации и проявляют мультипотентные способности. ^[282]По сравнению со взрослыми стволовыми клетками клетки DFAT демонстрируют уникальные преимущества в изобилии, изолированности и однородности. При правильной индукционной культуре in vitro или надлежащей среде in vivo клетки DFAT могут демонстрировать адипогенный, остеогенный, хондрогенный и миогенный потенциалы. Они также могут проявлять периваскулярные характеристики и вызывать неоваскуляризацию. ^{[283] [284] [285]}

Хондрогенные клетки [ править ]

Хрящ - это соединительная ткань, отвечающая за движение суставов без трения. Его дегенерация в конечном итоге приводит к полной потере функции суставов на поздних стадиях остеоартрита . Как бессосудистая и гипоцеллюлярная ткань хрящ имеет ограниченную способность к самовосстановлению. Хондроциты - единственный тип клеток в хряще, в котором они окружены внеклеточным матриксом, который они секретируют и собирают.

Один из методов получения хряща - индуцировать его из iPS-клеток. ^{[286] В} качестве альтернативы, можно напрямую преобразовать фибробласты в индуцированные хондрогенные клетки (iChon) без промежуточной стадии iPS-клеток, вставив три фактора репрограммирования (c-MYC, KLF4 и SOX9). ^[287] Клетки iChon человека экспрессировали гены-маркеры хондроцитов (коллаген типа II), но не фибробластов.

Имплантированные в дефекты суставного хряща крыс, человеческие клетки iChon выживали, образуя хрящевую ткань, по крайней мере, в течение четырех недель без опухолей. В этом методе используется c-MYC, который, как считается, играет важную роль в онкогенезе, и ретровирус используется для введения факторов репрограммирования, что исключает его неизменное использование в терапии человека. ^{[256] [258] [288]}

Источники клеток для перепрограммирования [ править ]

Наиболее часто используемыми источниками для перепрограммирования являются клетки крови ^{[289] [290] [291] [292] [293]} и фибробласты, полученные при биопсии кожи ^[294], но получение клеток из мочи менее инвазивно. ^{[295] [296] [297] [298]} Последний метод не требует биопсии или забора крови. По состоянию на 2013 год стволовые клетки, полученные из мочи, были дифференцированы на эндотелиальные, остеогенные, хондрогенные, адипогенные, скелетные миогенные и нейрогенные линии без образования тератом. ^[299]Следовательно, их эпигенетическая память подходит для репрограммирования в iPS-клетки. Однако в моче появляется небольшое количество клеток, была достигнута только низкая эффективность преобразования и риск бактериального заражения относительно высок.

Еще одним многообещающим источником клеток для репрограммирования являются мезенхимальные стволовые клетки, полученные из волосяных фолликулов человека. ^[300]

Происхождение соматических клеток, используемых для репрограммирования, может влиять на эффективность репрограммирования ^{[301] [302],} функциональные свойства полученных индуцированных стволовых клеток ^[303] и способность образовывать опухоли. ^{[304] [305]}

IPSC сохраняют эпигенетическую память о своей ткани происхождения, что влияет на их способность к дифференцировке. ^{[288] [303] [306] [307] [308] [309]} Эта эпигенетическая память не обязательно проявляется на стадии плюрипотентности - ИПСК, полученные из разных тканей, обладают правильной морфологией, экспрессируют маркеры плюрипотентности и способны дифференцироваться в три эмбриональных слоя in vitro и in vivo. Однако эта эпигенетическая память может проявляться во время повторной дифференцировки в определенные типы клеток, которым требуются определенные локусы, несущие остаточные эпигенетические метки.

См. Также [ править ]

В Викиверситете есть учебные ресурсы об индуцированных стволовых клетках

Ссылки [ править ]