Дефо дебютировал в кино в фильме Майкла Чимино « Врата рая» (1980), а затем получил свою первую номинацию на премию « Оскар» за военный фильм Оливера Стоуна « Взвод» (1986). В 1988 году он снялся в роли Иисуса Христа в религиозной эпопее Мартина Скорсезе « Последнее искушение Христа» и в роли агента ФБР Алана Паркера в расовой драме « Миссисипи в огне » . Он также появлялся в фильмах Стоуна « Рожденный четвертого июля» (1989), « Плакса » Джона Уотерса (1990), « Дикие сердцем » Дэвида Линча .(1990), « Английский пациент » Энтони Мингеллы (1996) и « Американский психопат » Мэри Харрон (2000).
В 2002 году он получил международное признание за роль Нормана Осборна / Зеленого гоблина в фильме Сэма Рэйми « Человек-паук» (2002), а также за роль в фильмах « Человек-паук 2» (2004), «Человек-паук 3» (2007) и «Человек-паук 3». фильм кинематографической вселенной Marvel (MCU) « Человек-паук: Пути домой нет» (2021). Он также стал известен своими появлениями в фильмах Уэса Андерсона , в том числе «Водная жизнь со Стивом Зиссу » (2004 г.), « Фантастический мистер Фокс» (2009 г.), «Отель Гранд Будапешт» (2014 г.) и «Французский диспетчер».(2021). В 21 веке он получил признание критиков и был номинирован на награды за свои роли в фильмах Шона Бейкера « Флорида проект» (2017), Джулиана Шнабеля « У ворот вечности» (2018) и Роберта Эггерса « Маяк » (2019).
Он получил множество наград и номинаций за свои выступления, в том числе четыре номинации на премию Оскар, номинацию на премию Британской киноакадемии , три номинации на премию « Золотой глобус» и четыре номинации на премию Гильдии киноактеров .