Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Микротитрационный планшет после анализа МТТ. Увеличение количества клеток привело к усилению пурпурной окраски.

Анализ МТТ является колориметрический анализ для оценки клеточного метаболической активности. [1] NAD (P) H-зависимые клеточная оксидоредуктаза ферменты может, при определенных условиях, отражает число жизнеспособных клеток , присутствующие. Эти ферменты способны снижать тетразолия краситель МТТ 3- (4,5 - ди - метил - тиазол - 2-ил) -2,5-ди - фенил тетразолия бромид его нерастворимого формазана, имеющий пурпурный цвет. Другие близкородственные тетразолиевые красители, включая XTT, MTS и WST, используются вместе с промежуточным акцептором электронов, метосульфатом 1-метоксифеназина (PMS). С WST-1, который является непроницаемым для клеток, восстановление происходит вне клетки посредством транспорта электронов через плазматическую мембрану. [2] Однако это традиционно предполагаемое объяснение в настоящее время оспаривается, поскольку также было найдено доказательство восстановления МТТ до формазана в липидных клеточных структурах без очевидного участия оксидоредуктаз. [3]

Анализы с красителем тетразолием также можно использовать для измерения цитотоксичности (потеря жизнеспособных клеток) или цитостатической активности (переход от пролиферации к состоянию покоя) потенциальных лекарственных средств и токсичных материалов. Анализы МТТ обычно проводят в темноте, поскольку реагент МТТ чувствителен к свету.

МТТ и родственные соли тетразолия [ править ]

Снижение МТТ

МТТ , желтый тетразол , в живых клетках восстанавливается до пурпурного формазана . [4] Раствор для солюбилизации (обычно диметилсульфоксид , подкисленный раствор этанола или раствор детергента додецилсульфата натрия в разбавленной соляной кислоте ) добавляют для растворения нерастворимого пурпурного продукта формазана в окрашенном растворе. Поглощение этого окрашенного раствора может быть количественно определена путем измерения при определенной длине волны (обычно от 500 до 600 нм) с помощью спектрофотометра. Степень поглощения света зависит от степени концентрации формазана, накопленной внутри клетки и на ее поверхности. Чем выше концентрация формазана, тем более глубокий пурпурный цвет и, следовательно, выше поглощение.

XTT (2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолий-5-карбоксанилид) был предложен для замены MTT, обеспечивая более высокую чувствительность и более высокий динамический диапазон. Образовавшийся краситель формазан растворим в воде, что позволяет избежать стадии окончательной солюбилизации. [5]

Водорастворимые соли тетразолия являются более поздней альтернативой МТТ: они были разработаны путем введения положительных или отрицательных зарядов и гидроксигрупп в фенильное кольцо соли тетразолия или, что лучше, с сульфонатными группами, добавленными прямо или косвенно к фенильному кольцу.

MTS (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолий) в присутствии феназинметосульфата ( PMS), образует формазановый продукт с максимумом поглощения при 490 нм в фосфатно-солевом буфере. Анализ MTS часто описывается как «одностадийный» анализ МТТ, который предлагает удобство добавления реагента прямо в культуру клеток без периодических шагов, требуемых в анализе МТТ. Однако это удобство делает анализ MTS чувствительным к колориметрической интерференции, поскольку прерывистые шаги в анализе MTT удаляют следы окрашенных соединений, в то время как они остаются в микротитровальном планшете в одноэтапном анализе MTS. Необходимы меры предосторожности для обеспечения точности при использовании этого анализа, и есть веские аргументы в пользу подтверждения результатов MTS с использованием качественных наблюдений под микроскопом. (Это, однако, разумно для всех колориметрических анализов.) [6]

WST (водорастворимые соли тетразолия) представляют собой серию других водорастворимых красителей для анализов МТТ, разработанных для получения различных спектров поглощения образующихся формазанов. [7] WST-1 и, в частности, WST-8 (2- (2-метокси-4-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфофенил) -2H-тетразолий) являются предпочтительными по сравнению с МТТ в том смысле, что они восстанавливаются вне клеток в сочетании с электронным медиатором PMS и дают водорастворимый формазан. Наконец, анализы WST (1) можно считывать напрямую (в отличие от МТТ, который требует стадии солюбилизации), (2) дают более эффективный сигнал, чем МТТ, и (3) снижают токсичность для клеток (в отличие от проницаемого для клеток МТТ и его нерастворимого формазан, которые накапливаются внутри клеток). [7]

Значение теста МТТ [ править ]

Обычно предполагается, что восстановление тетразолиевого красителя зависит от NAD (P) H-зависимых ферментов оксидоредуктазы в основном в цитозольном компартменте клетки. [2] [8] Таким образом, уменьшение МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от клеточной метаболической активности за счет потока НАД (Ф) Н. Клетки с низким метаболизмом, такие как тимоциты и спленоциты, очень мало снижают МТТ. Напротив, быстро делящиеся клетки демонстрируют высокие скорости снижения МТТ. Важно иметь в виду, что условия анализа могут изменять метаболическую активность и, таким образом, восстановление тетразолиевого красителя, не влияя на жизнеспособность клеток. Кроме того, механизм восстановления тетразолиевых красителей, т.е. внутриклеточный (МТТ, MTS) vs.внеклеточный (WST-1), также будет определять количество продукта. Кроме того, были представлены доказательства спонтанного снижения МТТ в липидных клеточных компартментах / структурах без участия ферментативного катализа. [3] Тем не менее, даже в рамках этой альтернативной парадигмы, анализ МТТ по-прежнему оценивает восстановительный потенциал клетки (то есть доступность восстанавливающих соединений для управления клеточной энергией). [1] Таким образом, окончательная интерпретация жизнеспособности клеток остается неизменной.

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (апрель 2018 г.). «Соли тетразолия и продукты формазана в клеточной биологии: оценка жизнеспособности, флуоресцентная визуализация и перспективы маркировки» (PDF) . Acta Histochemica . 120 (3): 159–167. DOI : 10.1016 / j.acthis.2018.02.005 . PMID  29496266 .
  2. ^ a b Берридж М.В., Херст П.М., Тан А.С. (2005). «Тетразолиевые красители как инструменты в клеточной биологии: новый взгляд на их клеточное сокращение». Годовой обзор биотехнологии . 11 : 127–52. DOI : 10.1016 / S1387-2656 (05) 11004-7 . ISBN 9780444519528. PMID  16216776 .
  3. ^ a b Stockert JC, Blázquez-Castro A, Cañete M, Horobin RW, Villanueva A (декабрь 2012 г.). «МТТ-анализ жизнеспособности клеток: внутриклеточная локализация формазанового продукта - липидные капли». Acta Histochemica . 114 (8): 785–96. DOI : 10.1016 / j.acthis.2012.01.006 . PMID 22341561 . 
  4. ^ Mosmann T (декабрь 1983). «Быстрый колориметрический анализ клеточного роста и выживаемости: применение для анализа пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 55–63. DOI : 10.1016 / 0022-1759 (83) 90303-4 . PMID 6606682 . 
  5. ^ «Почему я должен использовать XTT вместо MTT» (PDF, 0,1 МБ) . [aniara.com] . АНИАРА . Проверено 19 ноября 2010 .
  6. ^ Кори AH, Оуэн TC, Barltrop JA, Кори JG (июль 1991). «Использование водорастворимого анализа тетразолия / формазана для анализа роста клеток в культуре». Раковые коммуникации . 3 (7): 207–12. DOI : 10.3727 / 095535491820873191 . PMID 1867954 . 
  7. ^ a b «Водорастворимые соли тетразолия (WST)» (PDF, 0,4 МБ) . [interchim.com] . Интерхим . Проверено 12 августа 2013 .
  8. ^ Берридж М.В., Tan AS (июнь 1993). «Характеристика клеточного восстановления 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ): субклеточная локализация, зависимость от субстрата и участие митохондриального транспорта электронов в восстановлении МТТ». Архивы биохимии и биофизики . 303 (2): 474–82. DOI : 10.1006 / abbi.1993.1311 . PMID 8390225 . 

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Уилсон А.П. (2000). «Глава 7: Цитотоксичность и жизнеспособность». В Мастерс JR (ред.). Культура клеток животных: практический подход . 1 (3-е изд.). Оксфорд: Издательство Оксфордского университета . ISBN 978-0-19-963796-6. LCCN  00026267 . OCLC  43555390 .
  • Бернас Т., Добруцкий Дж. (Апрель 2002 г.). «Митохондриальное и немитохондриальное восстановление МТТ: взаимодействие МТТ с митохондриальными флуоресцентными зондами TMRE, JC-1 и NAO» . Цитометрия . 47 (4): 236–42. DOI : 10.1002 / cyto.10080 . PMID  11933013 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Протокол анализа МТТ