Пептидный массовый фингерпринт ( PMF ) (также известный как протеиновый фингерпринтинг ) - это аналитический метод идентификации белков, при котором интересующий неизвестный белок сначала расщепляется на более мелкие пептиды , абсолютные массы которых можно точно измерить с помощью масс-спектрометра, такого как MALDI-TOF. или ESI-TOF . [1] Метод был разработан в 1993 году несколькими группами независимо друг от друга. [2] [3] [4] [5] [6]Массы пептидов сравнивают либо с базой данных, содержащей известные белковые последовательности, либо даже с геномом. Это достигается с помощью компьютерных программ, которые переводят известный геном организма в белки, затем теоретически разрезают белки на пептиды и вычисляют абсолютные массы пептидов из каждого белка. Затем они сравнивают массы пептидов неизвестного белка с теоретическими массами пептидов каждого белка, кодируемого в геноме. Результаты статистически анализируются, чтобы найти наилучшее соответствие.
Преимущество этого метода заключается в том, что необходимо знать только массы пептидов. В этом случае нет необходимости в трудоемком секвенировании пептидов de novo . Недостатком является то, что последовательность белка должна присутствовать в интересующей базе данных. Кроме того, большинство алгоритмов PMF предполагают, что пептиды происходят из одного белка. [7] Присутствие смеси может значительно усложнить анализ и потенциально поставить под угрозу результаты. Типичным для идентификации белка на основе PMF является требование изолированного белка. Смеси, в которых количество белков превышает 2-3, обычно требуют дополнительного использования идентификации белков на основе МС / МС для достижения достаточной специфичности идентификации (6). Поэтому типичные образцы PMF представляют собой изолированные белки издвумерный гель-электрофорез (2D-гели) или изолированные полосы SDS-PAGE . Дополнительные анализы с помощью МС / МС могут быть прямыми, например, анализ MALDI-TOF / TOF или последующий анализ наноЖХ-ESI-МС / МС элюатов пятен геля. [7] [8]
Истоки [ править ]
Из-за долгого и утомительного процесса анализа белков был разработан массовый фингерпринт пептидов. При анализе белков использовалась деградация по Эдману, и для анализа одного аминокислотного остатка требовалось почти час. [9] SDS-PAGE также использовался для разделения белков в очень сложных смесях, в которых также использовались методы электроблоттинга и окрашивания. [10] Затем полосы будут извлечены из геля и секвенированы автоматически. Повторяющейся проблемой в этом процессе было то, что мешающие белки также очищались с помощью интересующего белка. Последовательности этих интерферирующих белков были скомпилированы в так называемую базу данных Dayhoff. [11] В конечном итоге наличие последовательностей этих известных белковых примесей в базах данных сократило время работы прибора и расходы, связанные с анализом белков.
Подготовка образца [ править ]
Образцы белка могут быть получены с помощью SDS-PAGE [7] или обращенно-фазовой ВЭЖХ , а затем могут быть подвергнуты некоторым химическим модификациям. Дисульфидные мостики в белках восстанавливаются, а аминокислоты цистеина химически карбамидометилируются или акриламидируются во время гель-электрофореза.
Затем белки разрезают на несколько фрагментов с помощью протеолитических ферментов, таких как трипсин , химотрипсин или Glu-C . Типичное соотношение образец: протеаза составляет 50: 1. Протеолиз обычно проводят в течение ночи, а полученные пептиды экстрагируют ацетонитрилом и сушат в вакууме. Затем пептиды растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды или дополнительно концентрируют и очищают и готовы к масс-спектрометрическому анализу.
Масс-спектрометрический анализ [ править ]
Расщепленный белок можно анализировать с помощью различных типов масс-спектрометров, таких как ESI-TOF или MALDI-TOF . MALDI-TOF часто является предпочтительным инструментом, поскольку он обеспечивает высокую пропускную способность и позволяет анализировать несколько белков в одном эксперименте, если его дополнять анализом МС / МС . LC / ESI-MS и CE / ESI-MS также являются отличными методами для снятия отпечатков пептидных масс. [12] [13]
Небольшую фракцию пептида (обычно 1 микролитр или меньше) пипеткой наносят на мишень MALDI, и к смеси пептидов добавляют химическое вещество, называемое матрицей . Обычными матрицами являются синапиновая кислота , альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота и 2,3-дигидроксибензойная кислота . Молекулы матрицы необходимы для десорбции молекул пептида. Молекулы матрицы и пептида совместно кристаллизуются на мишени MALDI и готовы к анализу. Существует один метод подготовки образцов, в котором используется преимущественно MALDI-MS, а именно метод высушенных капель. [14]Мишень вставляется в вакуумную камеру масс-спектрометра, и десорбция и ионизация полипептидных фрагментов инициируются импульсным лазерным лучом, который передает большое количество энергии молекулам матрицы. Передачи энергии достаточно, чтобы способствовать ионизации и переходу молекул матрицы и пептидов из твердой фазы в газовую фазу. Ионы ускоряются в электрическом поле масс-спектрометра и летят к детектору ионов, где их прибытие регистрируется как электрический сигнал. Их отношение массы к заряду пропорционально их времени полета (TOF) в дрейфовой трубе и может быть рассчитано соответствующим образом.
Связывание ESI с капиллярной LC позволяет отделить пептиды от перевариваемых белков, одновременно получая их молекулярные массы. [15] Капиллярный электрофорез в сочетании с ESI-MS - еще один метод; однако лучше всего он работает при анализе небольших количеств белков. [13]
Вычислительный анализ [ править ]
Масс-спектрометрический анализ дает список молекулярных масс фрагментов, который часто называют списком пиков. Массы пептидов сравнивают с базами данных белков, такими как Swissprot , которые содержат информацию о последовательности белков. Программное обеспечение выполняет расщепление in silico белков в базе данных с помощью того же фермента (например, трипсина), который используется в реакции химического расщепления. Затем рассчитывают массу этих пептидных фрагментов и сравнивают со списком пиков измеренных масс пептидов. Результаты статистически анализируются, а возможные совпадения возвращаются в таблице результатов.
См. Также [ править ]
- Масс-спектрометрия белков
- Протеомика дробовика
- Нисходящая протеомика
- Восходящая протеомика
Ссылки [ править ]
- ^ Клаузера КР, Бейкер Р, Бурлингейм Л. (1999). «Роль точного измерения массы (+/- 10 ppm) в стратегиях идентификации белков с использованием МС или МС / МС и поиска в базе данных». Анальный. Chem . 71 (14): 2871–82. DOI : 10.1021 / ac9810516 . PMID 10424174 .
- ^ Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ (1993). «Быстрая идентификация белков путем снятия отпечатков пальцев по массе пептидов». Curr. Биол . 3 (6): 327–32. DOI : 10.1016 / 0960-9822 (93) 90195-Т . PMID 15335725 .
- ^ Энзел WJ, Billeci ТМ, Stults JT, Вонг СК, Grimley С, Ватанабе С (1993). «Идентификация белков из двумерных гелей путем молекулярно-массового поиска пептидных фрагментов в базах данных последовательностей белков» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 90 (11): 5011–5. Bibcode : 1993PNAS ... 90.5011H . DOI : 10.1073 / pnas.90.11.5011 . PMC 46643 . PMID 8506346 .
- ^ Mann М, Højrup P, Roepstorff P (1993). «Использование масс-спектрометрической информации о молекулярной массе для идентификации белков в базах данных последовательностей». Биологическая масс-спектрометрия . 22 (6): 338–45. DOI : 10.1002 / bms.1200220605 . PMID 8329463 .
- ^ Джеймс P, Quadroni M, Carafoli E, Гонне G (1993). «Идентификация белков по отпечаткам пальцев массового профиля». Biochem. Биофиз. Res. Commun . 195 (1): 58–64. DOI : 10.1006 / bbrc.1993.2009 . PMID 8363627 .
- ^ Йейтс JR, Шпайхер S, PR - Гриффин, Hunkapiller Т (1993). «Массовые карты пептидов: высокоинформативный подход к идентификации белков». Анальный. Biochem . 214 (2): 397–408. DOI : 10.1006 / abio.1993.1514 . PMID 8109726 .
- ^ a b c Шевченко А., Йенсен О.Н., Подтелейников А.В., Саглиокко Ф., Вильм М., Ворм О, Мортенсен П., Шевченко А., Бушери Х, Манн М. (1996). «Связывание генома и протеома с помощью масс-спектрометрии: широкомасштабная идентификация дрожжевых белков из двухмерных гелей» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 93 (25): 14440–5. Bibcode : 1996PNAS ... 9314440S . DOI : 10.1073 / pnas.93.25.14440 . PMC 26151 . PMID 8962070 .
- ^ Ван W, вс J, Nimtz M, Deckwer WD, Цзэн AP (2003). «Идентификация белков из анализа двумерного гель-электрофореза Klebsiella pneumoniae путем комбинированного использования данных масс-спектрометрии и исходных последовательностей генома» . Протеомная наука . 1 (1): 6. DOI : 10,1186 / 1477-5956-1-6 . PMC 317362 . PMID 14653859 .
- ^ Хензель, Уильям Дж .; Ватанабэ, Колин; Стултс, Джон Т. (01.09.2003). «Идентификация белков: происхождение фингерпринта пептидной массы» . Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 14 (9): 931–942. DOI : 10.1016 / S1044-0305 (03) 00214-9 . ISSN 1044-0305 . PMID 12954162 .
- ^ Матсудайра, P. (1987-07-25). «Последовательность пикомольных количеств белков, нанесенных электроблоттингом на поливинилидендифторидные мембраны». Журнал биологической химии . 262 (21): 10035–10038. ISSN 0021-9258 . PMID 3611052 .
- ^ BC Orcutt; DG George; Дэйхофф и МО (1983). "Системы баз данных последовательностей белков и нуклеиновых кислот". Ежегодный обзор биофизики и биоинженерии . 12 (1): 419–441. DOI : 10.1146 / annurev.bb.12.060183.002223 . PMID 6347043 .
- ^ Мур, RE; Licklider, L .; Schumann, D .; Ли, Т. Д. (1998-12-01). «Микромасштабный интерфейс электроспрея, включающий монолитную основу из поли (стирол-дивинилбензол) для жидкостной хроматографии / тандемного масс-спектрометрического анализа пептидов и белков». Аналитическая химия . 70 (23): 4879–4884. DOI : 10.1021 / ac980723p . ISSN 0003-2700 . PMID 9852776 .
- ^ a b Уитмор, Колин Д .; Дженнаро, Линн А. (01.06.2012). «Методы капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии для триптического пептидного картирования терапевтических антител». Электрофорез . 33 (11): 1550–1556. DOI : 10.1002 / elps.201200066 . ISSN 1522-2683 . PMID 22736356 .
- ^ Thiede Бернд (2005). «Массовая дактилоскопия пептидов». Методы . 35 (3): 237–247. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2004.08.015 . PMID 15722220 .
- ^ Дасс, Chhabil (2007). Основы современной масс-спектрометрии | Интернет-книги Wiley . DOI : 10.1002 / 0470118490 . ISBN 9780470118498.
Внешние ссылки [ править ]
| Ресурсы библиотеки о массовом дактилоскопировании пептидов |
|
