Фотореактивные аналоги аминокислот представляют собой искусственные аналоги природных аминокислот, которые можно использовать для сшивания белковых комплексов. [1] Фотореактивные аналоги аминокислот могут быть включены в белки и пептиды in vivo или in vitro . Широко используемые фотореактивные аналоги аминокислот представляют собой фотореактивные диазириновые аналоги лейцина и метионина и пара - бензоилфенилаланин. Под воздействием ультрафиолетового света они активируются и ковалентно связываются с взаимодействующими белками, которые находятся в пределах нескольких ангстрем от фотореактивного аналога аминокислоты.
L - фотолейцин и L - фотометионин являются аналогами встречающихся в природе аминокислот L -лейцин и L-метионин , которые эндогенно включаются в первичную последовательность белков во время синтеза с использованием нормального механизма трансляции. Затем они активируются ультрафиолетовым светом (УФ) для ковалентного сшивания белков в доменах межбелкового взаимодействия в их нативной среде in vivo . Метод позволяет определять и характеризовать как стабильные, так и временные взаимодействия белков в клетках без добавления химических сшивающих агентов и связанных с ними растворителей, которые могут неблагоприятно повлиять на изучаемую в эксперименте клеточную биологию .
При использовании в сочетании с лимитирующей средой, не содержащей лейцина и метионина, фотоактивируемые производные обрабатываются механизмом синтеза клеточного белка как встречающиеся в природе аминокислоты. В результате они могут замещать лейцин или метионин в первичной структуре белков. Производные фотолейцина и фотометионина содержат диазириновые кольца, которые активируются под воздействием УФ-излучения, превращаясь в реакционноспособные промежуточные соединения, образующие ковалентные связи с близлежащими боковыми цепями и скелетами белка. Естественно взаимодействующие белки внутри клетки могут быть мгновенно захвачены фотоактивацией .диазиринсодержащих белков в культивируемых клетках. Сшитые белковые комплексы можно обнаружить по снижению подвижности в SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом , эксклюзионной хроматографией , седиментацией в градиенте плотности сахарозы или масс-спектрометрией .