Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Фотография конфокального рамановского микроскопа
Конфокальный рамановский микроскоп
Фотография рамановского микроскопа с корпусом для образца
Рамановский микроскоп

Комбинационный микроскоп представляет собой лазер на основе микроскопического устройство , используемое для выполнения спектроскопии комбинационного рассеяния . [1] Термин MOLE (молекулярно-оптический лазерный исследователь) используется для обозначения рамановского микрозонда. [1] Используемая методика названа в честь К.В. Рамана , открывшего свойства рассеяния в жидкостях. [2]

Конфигурация [ править ]

Рамановский микроскоп начинается со стандартного оптического микроскопа и добавляет в него возбуждающий лазер , фильтры , отклоняющие лазер , спектрометр или монохроматор и оптический чувствительный детектор, такой как устройство с зарядовой связью (CCD) или фотоэлектронный умножитель (PMT). Традиционно рамановская микроскопия использовалась для измерения рамановского спектра точки на образце, в последнее время этот метод был расширен для реализации рамановской спектроскопии для прямого химического построения изображений по всему полю зрения на трехмерном образце.

Режимы визуализации [ править ]

При прямой визуализации все поле зрения исследуется на предмет рассеяния в небольшом диапазоне волновых чисел (рамановские сдвиги). Например, характеристику волнового числа для холестерина можно использовать для регистрации распределения холестерина в культуре клеток. Другой подход - это гиперспектральная визуализация или химическая визуализация , при которой тысячи спектров комбинационного рассеяния получают со всего поля зрения. Затем данные можно использовать для создания изображений, показывающих расположение и количество различных компонентов. Взяв пример с культурой клеток, гиперспектральное изображение может показать распределение холестерина [3], а также белков, нуклеиновых и жирных кислот. [4] [5] [6] Сложные методы обработки сигналов и изображений могут использоваться, чтобы игнорировать присутствие воды, питательных сред, буферов и других помех.

Разрешение [ править ]

Рамановская микроскопия и, в частности, конфокальная микроскопия , могут достигать субмикрометрового поперечного пространственного разрешения. [7] Поскольку рамановский микроскоп представляет собой систему с ограничением дифракции , его пространственное разрешение зависит от длины волны света и числовой апертуры.фокусирующего элемента. В конфокальной рамановской микроскопии диаметр конфокальной апертуры является дополнительным фактором. Как показывает опыт, поперечное пространственное разрешение может достигать приблизительно длины волны лазера при использовании линз воздушного объектива, в то время как масляные или водные иммерсионные объективы могут обеспечивать поперечное разрешение примерно на половину длины волны лазера. Это означает, что при работе в диапазоне от видимого до ближнего инфракрасного диапазона рамановский микроскоп может достигать поперечного разрешения прибл. От 1 мкм до 250 нм, в то время как разрешение по глубине (если не ограничивается глубиной оптического проникновения образца) может варьироваться от 1-6 мкм с наименьшей конфокальной апертурой крошечного отверстия до 10s микрометров при работе без конфокального точечного отверстия. [8] [9] [10]Поскольку линзы объективов микроскопов фокусируют лазерный луч до микрометрового диапазона, результирующий поток фотонов намного выше, чем достигается в обычных рамановских установках. Это дает дополнительное преимущество в виде улучшенного фотообесцвечивания молекул, излучающих мешающую флуоресценцию. Однако высокий поток фотонов также может вызвать деградацию образца, и поэтому для каждого типа образца необходимо тщательно выбирать длину волны и мощность лазера.

Рамановская визуализация [ править ]

Химическое изображение фармацевтической эмульсии, полученное с помощью конфокальной рамановской микроскопии (микроскоп alpha300, WITec; синий: активный фармацевтический ингредиент, зеленый: масло, красный: примеси кремния).

Еще один инструмент, который становится все более популярным - это глобальная рамановская визуализация. Этот метод используется для определения характеристик крупномасштабных устройств, картирования различных соединений и исследования динамики. Он уже использовался для характеристики слоев графена , [11] J-агрегированных красителей внутри углеродных нанотрубок и множества других 2D-материалов, таких как MoS 2 [12] и WSe 2.. Поскольку возбуждающий луч рассеивается по всему полю зрения, эти измерения можно проводить без повреждения образца. Используя рамановскую микроскопию, in vivo могут быть измерены рамановские спектры микроскопических областей образцов с временным и пространственным разрешением. В результате можно устранить флуоресценцию воды, среды и буферов. Следовательно, целесообразно исследовать белки, клетки и органеллы.

Рамановская микроскопия для биологических и медицинских образцов обычно использует лазеры ближнего инфракрасного диапазона (БИК) ( особенно распространены диоды с длиной волны 785 нм и Nd: YAG с длиной волны 1064 нм ). Это снижает риск повреждения образца из-за воздействия более высоких длин волн. Однако интенсивность БИК-комбинационного рассеяния мала (из-за зависимости интенсивности комбинационного рассеяния от ω 4 ), и для большинства детекторов требуется очень большое время сбора. В последнее время стали доступны более чувствительные детекторы, что сделало этот метод более пригодным для общего использования. Рамановская микроскопия неорганических образцов, таких как горные породы, керамика и полимеры [13], может использовать более широкий диапазон длин волн возбуждения.

Родственный метод, рамановская спектроскопия с усилением наконечника , может создавать гиперспектральные изображения с высоким разрешением одиночных молекул [14] и ДНК. [15]

Корреляционная рамановская визуализация [ править ]

Корреляционная рамановская электронно-микроскопическая микроскопия гематита (полученная с помощью микроскопа RISE, WITec). Рамановское изображение накладывается на СЭМ-изображение.

Конфокальную рамановскую микроскопию можно комбинировать с множеством других методов микроскопии. Используя разные методы и соотнося данные, пользователь достигает более полного понимания образца. Распространенными примерами методов корреляционной микроскопии являются Рамановская АСМ , [16] [13] Рамановская СБОМ , [17] и Рамановская СЭМ . [18]

Корреляционная СЭМ-Рамановская визуализация - это интеграция конфокального рамановского микроскопа в камеру СЭМ, которая позволяет получать корреляционные изображения с помощью нескольких методов, таких как SE, BSE, EDX , EBSD , EBIC , CL , AFM . [19] Образец помещается в вакуумную камеру электронного микроскопа. Оба метода анализа затем выполняются автоматически в одном и том же месте пробы. Затем полученные SEM и рамановские изображения могут быть наложены друг на друга. [20] [21] Кроме того, добавление сфокусированного ионного пучка(FIB) на камере позволяет удалить материал и, следовательно, получить трехмерное изображение образца. Режим низкого вакуума позволяет анализировать биологические и непроводящие образцы.

Биологические приложения [ править ]

Используя рамановскую микроскопию , in vivo могут быть измерены рамановские спектры микроскопических областей образцов с временным и пространственным разрешением. Отбор проб является неразрушающим, и вода, среда и буферы обычно не мешают анализу. Следовательно, рамановская спектроскопия с временным и пространственным разрешением in vivo подходит для исследования белков , клеток и органов.. В области микробиологии конфокальная рамановская микроскопия использовалась для картирования внутриклеточного распределения макромолекул, таких как белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и полимерные включения, такие как поли-β-гидроксимасляная кислота и полифосфаты в бактериях и стеролы в микроводорослях. Сочетание экспериментов по стабильному изотопному зондированию (SIP) с конфокальной рамановской микроскопией позволило определить скорость ассимиляции 13 C и 15 N-субстратов, а также D 2 O отдельными бактериальными клетками. [22]

См. Также [ править ]

  • Рамановское рассеяние
  • Когерентная микроскопия комбинационного рассеяния
  • Растровый электронный микроскоп
  • Рамановская спектроскопия с усилением наконечника

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Микроскопические методы в использовании рамановского микрозонда лазерного исследователя молекулярной оптики , М. Е. Андерсен, Р. З. Муггли, Аналитическая химия, 1981, 53 (12), стр 1772–1777 [1]
  2. ^ Кришнан, KS; Раман, CV (1928). «Новый тип вторичного излучения». Природа . 121 (3048): 501–502. DOI : 10.1038 / 121501c0 . ISSN  1476-4687 .
  3. ^ Матфей, ​​Кристиан; Крафт, Кристоф; Дицек, Бенджамин; Brehm, Bernhard R .; Лорковски, Стефан; Попп, Юрген (2012-10-16). «Неинвазивная визуализация внутриклеточного метаболизма липидов в макрофагах с помощью рамановской микроскопии в сочетании со стабильной изотопной маркировкой». Аналитическая химия . 84 (20): 8549–8556. DOI : 10.1021 / ac3012347 . ISSN 0003-2700 . PMID 22954250 .  
  4. ^ Баранска, Малгожата; Хлопицки, Стефан; Федорович, Анджей; Качамакова-Трояновская, Нели; Качор, Агнешка; Майзнер, Катажина (2012-12-10). «Трехмерная конфокальная рамановская визуализация эндотелиальных клеток и сосудистой стенки: перспективы в аналитической спектроскопии биомедицинских исследований». Аналитик . 138 (2): 603–610. DOI : 10.1039 / C2AN36222H . ISSN 1364-5528 . PMID 23172339 .  
  5. ^ Rygula, A .; Майзнер, К .; Marzec, KM; Качор, А .; Пиларчик, М .; Баранская, М. (01.08.2013). «Рамановская спектроскопия белков: обзор». Журнал Рамановской спектроскопии . 44 (8): 1061–1076. DOI : 10.1002 / jrs.4335 . ISSN 1097-4555 . 
  6. ^ Czamara, K .; Майзнер, К .; Pacia, MZ; Кочан, К .; Качор, А .; Баранская, М. (01.01.2015). «Рамановская спектроскопия липидов: обзор». Журнал Рамановской спектроскопии . 46 (1): 4–20. DOI : 10.1002 / jrs.4607 . ISSN 1097-4555 . 
  7. ^ Топорский, Ян; Умирающий, Томас; Холлрихер, Олаф, ред. (2018). Конфокальная рамановская микроскопия . Серия Спрингера по наукам о поверхности . 66 . DOI : 10.1007 / 978-3-319-75380-5 . ISBN 978-3-319-75378-2. ISSN  0931-5195 .
  8. ^ Нил Дж. Эвбалл (2009). «Конфокальная рамановская микроскопия: производительность, подводные камни и передовая практика» . Прикладная спектроскопия . 63 (9): 245A – 262A. DOI : 10.1366 / 000370209789379196 . ISSN 1943-3530 . PMID 19796478 .  
  9. ^ Поддержка Информация о Т. Шмид; Н. Шефер; С. Левченко; Т. Риссом; Д. Абу-Рас (2015). «Картографирование ориентации-распределения поликристаллических материалов методом рамановской микроскопии» . Научные отчеты . 5 : 18410. дои : 10.1038 / srep18410 . ISSN 2045-2322 . PMC 4682063 . PMID 26673970 .   
  10. ^ Лотар Opilik; Томас Шмид; Ренато Зеноби (2013). «Современная рамановская визуализация: колебательная спектроскопия на микрометрических и нанометровых шкалах». Ежегодный обзор аналитической химии . 6 : 379–398. DOI : 10,1146 / annurev-anchem-062012-092646 . ISSN 1936-1335 . PMID 23772660 .  
  11. ^ Шен, Цзэсян; Ю, Тинг; Ван, Иньин; Ни, Чжэньхуа (2008-10-01). «Рамановская спектроскопия и построение изображений графена». Нано-исследования . 1 (4): 273–291. arXiv : 0810.2836 . DOI : 10.1007 / s12274-008-8036-1 . ISSN 1998-0000 . 
  12. ^ Ли, Хай; Лу, банда; Инь, Цзунъю; Он, Циюань; Ли, Хун; Чжан, Цин; Чжан, Хуа (12 марта 2012 г.). «Оптическая идентификация одно- и многослойных листов MoS2». Маленький . 8 (5): 682–686. DOI : 10.1002 / smll.201101958 . ISSN 1613-6829 . PMID 22223545 .  
  13. ^ a b Schmidt, U .; Hild, S .; Ibach, W .; Холлрихер, О. (2005-12-01). «Характеристика тонких полимерных пленок в нанометровом масштабе с конфокальной рамановской АСМ». Макромолекулярные симпозиумы . 230 (1): 133–143. DOI : 10.1002 / masy.200551152 . ISSN 1521-3900 . 
  14. ^ Апкариан, В. Ара; Николас Талларида; Крэмптон, Кевин Т .; Ли, Джунхи (апрель 2019 г.). «Визуализация колебательных нормальных мод одиночной молекулы с атомарно ограниченным светом». Природа . 568 (7750): 78–82. DOI : 10.1038 / s41586-019-1059-9 . ISSN 1476-4687 . PMID 30944493 .  
  15. ^ Он, Чжэ; Хан, Зехуа; Кизер, Меган; Линхардт, Роберт Дж .; Ван, Син; Синюков Александр М .; Ван, Цзичжоу; Декерт, Фолькер; Соколов, Алексей В. (2019-01-16). «Рамановская визуализация одноцепочечной ДНК с улучшенным кончиком с разрешением одного основания». Журнал Американского химического общества . 141 (2): 753–757. DOI : 10.1021 / jacs.8b11506 . ISSN 0002-7863 . PMID 30586988 .  
  16. ^ Пиларчик, Марта; Рыгула, Анна; Качор, Агнешка; Матеушук, Лукаш; Маслак, Эдита; Хлопицки, Стефан; Баранска, Малгожата (01.11.2014). «Новый подход к исследованию сосудистой стенки в 3D: комбинированная спектроскопия комбинационного рассеяния и атомно-силовая микроскопия для визуализации аорты на лице». Колебательная спектроскопия . 75 : 39–44. DOI : 10.1016 / j.vibspec.2014.09.004 . ISSN 0924-2031 . 
  17. ^ Старк, Роберт В .; Хилленбранд, Райнер; Зиглер, Александр; Бауэр, Майкл; Хубер, Андреас Дж .; Гиглер, Александр М. (07.12.2009). «Наноразмерное картирование поля остаточных напряжений вокруг наноиндентов в SiC с помощью ИК s-SNOM и конфокальной рамановской микроскопии» . Оптика Экспресс . 17 (25): 22351–22357. DOI : 10,1364 / OE.17.022351 . ISSN 1094-4087 . PMID 20052158 .  
  18. ^ Карделл, Каролина; Герра, Изабель (01.03.2016). «Обзор новых систем SEM-EDX и рамановской спектроскопии с дефисами: приложения в биологических науках, окружающей среде и материаловедении». Тенденции TrAC в аналитической химии . 77 : 156–166. DOI : 10.1016 / j.trac.2015.12.001 . ISSN 0165-9936 . 
  19. ^ Jiruše, Jaroslav; Ганичинец, Мартин; Гавелка, Милослав; Холлрихер, Олаф; Ибах, Вольфрам; Спизиг, Питер (2014). «Объединение сфокусированного ионного пучка - растрового электронного микроскопа с конфокальным рамановским микроскопом в одном приборе». Журнал вакуумной науки и технологий B, Нанотехнологии и микроэлектроника: материалы, обработка, измерения и явления . 32 (6): 06FC03. DOI : 10.1116 / 1.4897502 .
  20. ^ Hollricher, Олаф; Шмидт, Юте; Бройнингер, Соня (ноябрь 2014 г.). "RISE Microscopy: Correlative Raman-SEM Imaging". Микроскопия сегодня . 22 (6): 36–39. DOI : 10.1017 / s1551929514001175 . ISSN 1551-9295 . 
  21. ^ Wille, G .; Lerouge, C .; Шмидт, У. (2018-06-01). «Мультимодальная микрохарактеризация зональности микроэлементов и кристаллографической ориентации в природном касситерите путем комбинирования катодолюминесценции, EBSD, EPMA и вклада конфокальной рамановской визуализации в SEM». Журнал микроскопии . 270 (3): 309–317. DOI : 10.1111 / jmi.12684 . ISSN 1365-2818 . PMID 29336485 .  
  22. ^ Мэдиган, М.Т., Бендер, К.С., Бакли, Д.Х., Саттли, В.М. и Шталь, Д.А. (2018) Брок, Биология микроорганизмов, Pearson Publ., NY, NY, 1022 стр.