Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из эксперимента с одной молекулой )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Одиночные молекулы полимера (цепи толщиной 0,4 нм) зарегистрированы в водной среде при различных значениях pH с помощью АСМ . Резкое изменение конформации полимерной цепи наблюдается при небольшом изменении pH. [1]

Одной молекулой эксперимент эксперимент , который исследует свойства отдельных молекул . Исследования одиночных молекул можно противопоставить измерениям ансамбля или совокупности молекул, где невозможно различить индивидуальное поведение молекул и можно измерить только средние характеристики. Поскольку многие методы измерения в биологии, химии и физике недостаточно чувствительны для наблюдения одиночных молекул, флуоресценция одиночных молекулметоды (которые появились с 1990-х годов для исследования различных процессов на уровне отдельных молекул) вызвали большой ажиотаж, поскольку они предоставили много новых деталей об измеряемых процессах, которые были недоступны в прошлом. Действительно, с 1990-х годов было разработано множество методов исследования отдельных молекул. [2]

Первые эксперименты с одной молекулой были экспериментами с фиксацией заплат, проведенными в 1970-х годах, но они были ограничены изучением ионных каналов . Сегодня системы, исследуемые с использованием методов одиночных молекул, включают движение миозина по актиновым филаментам в мышечной ткани и спектроскопические детали отдельных локальных сред в твердых телах. Конформации биологических полимеров были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью силовой спектроскопии отдельные молекулы (или пары взаимодействующих молекул), обычно полимеры , можно механически растянуть, а их упругий отклик записать в реальном времени.

История [ править ]

В газовой фазе при сверхнизких давлениях, одной молекулы эксперименты были вокруг в течение многих десятилетий, но в конденсированной фазе только с 1989 года , с работами WE Moerner и Лотар Kador. [3] Год спустя Мишель Оррит и Джеки Бернар смогли продемонстрировать также обнаружение поглощения одиночных молекул по их флуоресценции. [4]

Многие методы позволяют наблюдать одну молекулу за раз, особенно масс-спектрометрия , при которой обнаруживаются отдельные ионы. Для этого один из самых ранних средств обнаружения одиночных молекул, возникла в области ионных каналов с развитием патч зажима техники по Эрвин Неер и Берт Сакман (который позже пошел на Нобелевскую премию за их плодотворный вклад). Однако идея измерения проводимости для наблюдения за отдельными молекулами наложила серьезное ограничение на вид систем, которые можно было наблюдать.

Флуоресценция - удобный способ наблюдения за одной молекулой за раз, в основном из-за чувствительности коммерческих оптических детекторов, способных считать одиночные фотоны. Однако спектроскопически наблюдение одной молекулы требует, чтобы молекула находилась в изолированной среде и чтобы она испускала фотоны при возбуждении, что благодаря технологии обнаружения одиночных фотонов с помощью фотоумножителей (ФЭУ) или лавинных фотодиодов (ЛФД), позволяет регистрировать события эмиссии фотонов с большой чувствительностью и временным разрешением.

В последнее время флуоресценция одиночных молекул является предметом повышенного интереса для биологической визуализации благодаря маркировке биомолекул, таких как белки и нуклеотиды, для изучения ферментативной функции, которую нелегко изучить в массовом масштабе из-за тонких зависимых от времени движений в катализе и структурная реорганизация. Наиболее изученным белком был класс ферментов миозин / актин, обнаруженных в мышечных тканях. С помощью одномолекулярных методов ступенчатый механизм был обнаружен и охарактеризован во многих из этих белков.

Наноманипуляторы, такие как атомно-силовой микроскоп.также подходят для экспериментов с одной молекулой, имеющих биологическое значение, поскольку они работают в той же шкале длины, что и большинство биологических полимеров. Кроме того, атомно-силовая микроскопия (АСМ) подходит для исследования молекул синтетических полимеров. АСМ предоставляет уникальную возможность трехмерной визуализации полимерных цепей. Например, режим постукивания АСМ достаточно щадящий для регистрации адсорбированных молекул полиэлектролита (например, цепей поли (2-винилпиридина) толщиной 0,4 нм) в жидкой среде. Расположение двухцепочечной суперпозиции соответствует в этих экспериментах двойной толщине одиночной цепи (0,8 нм в случае упомянутого примера). При правильных параметрах сканирования конформация таких молекул остается неизменной в течение нескольких часов, что позволяет проводить эксперименты в жидких средах с различными свойствами.,[1] Кроме того, контролируя силу между наконечником и образцом, можно получить изображения с высоким разрешением. [5] [6] Оптический пинцет также использовался для изучения и количественной оценки ДНК-белковых взаимодействий. [5] [6]

Об экспериментах [ править ]

Концепция [ править ]

Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул использует флуоресценцию молекулы для получения информации о ее окружении, структуре и положении. Этот метод дает возможность получать информацию, которая иначе была бы недоступна из-за усреднения по ансамблю (то есть сигнал, полученный при одновременной записи множества молекул, представляет собой усредненное свойство динамики молекул). Результатом многих экспериментов с отдельными молекулами являются траектории с двумя состояниями .

Одноканальная запись [ править ]

См. Также: Патч-зажим
Два примера данных (~ 10 с каждый) из эксперимента с одноканальной записью с использованием метода фиксации патча. Верхний график соответствует более низкой концентрации, а нижний график записан при концентрации агониста, близкой к EC 50 этого ионного канала . Отверстия каналов представлены отклонениями вниз, в данном случае отклонениями приблизительно 5 пА.

Как и в случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул, метод, известный как одноканальная запись, может быть использован для получения конкретной кинетической информации - в данном случае о функции ионного канала - которая недоступна при ансамблевой записи, такой как запись всей клетки, выполнено. [7] В частности, ионные каналы чередуются между проводящими и непроводящими классами, которые различаются по конформации. Следовательно, функциональное состояние ионных каналов может быть непосредственно измерено с помощью достаточно чувствительной электроники при условии принятия надлежащих мер предосторожности для минимизации шума. В свою очередь, каждый из этих классов можно разделить на одно или несколько кинетических состояний, имеющих прямое отношение к основной функции ионного канала. Выполнение этих типов исследований отдельных молекул в систематически меняющихся условиях (например, концентрация и структура агониста, проникающий ион и / или блокатор каналов, мутации в аминокислотах ионного канала) может предоставить информацию, касающуюся взаимного преобразования различных кинетических состояний ионного канала. В минимальной модели ионного канала есть два состояния: открытые и закрытые. Однако для точного представления данных часто требуются другие состояния, включая несколько закрытых состояний, а также неактивные и / или десенсибилизированные состояния, которые являются непроводящими состояниями, которые могут возникать даже при наличии стимула. [7]

Маркировка биомолекул [ править ]

Отдельные флуорофоры могут быть химически присоединены к биомолекулам, таким как белки или ДНК, а динамику отдельных молекул можно отслеживать, отслеживая флуоресцентный зонд. Пространственные движения в пределах рэлеевского предела можно отслеживать вместе с изменениями интенсивности излучения и / или радиационного времени жизни, которые часто указывают на изменения в местной окружающей среде. Например, мечение одиночных молекул дало огромное количество информации о том, как моторные белки кинезина перемещаются вдоль нитей микротрубочек в мышечных клетках.

Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) [ править ]

Основная статья smFRET .

При резонансном переносе энергии флуоресценции одной молекулы молекула помечена (по крайней мере) в двух местах. Луч лазера фокусируется на молекуле, возбуждающей первый зонд. Когда этот зонд расслабляется и излучает фотон, у него есть шанс возбудить другой зонд. Эффективность поглощения фотона, испускаемого первым датчиком, во втором датчике зависит от расстояния между этими датчиками. Поскольку расстояние меняется со временем, этот эксперимент исследует внутреннюю динамику молекулы.

Одномолекулярные эксперименты против ансамблевых экспериментов [ править ]

При рассмотрении данных, относящихся к отдельным молекулам, обычно можно построить пропагаторы и функции плотности вероятности времени скачка первого порядка, второго порядка и так далее, тогда как из массовых экспериментов обычно получают затухание корреляционной функции. [8] Из информации, содержащейся в этих уникальных функциях (полученных от отдельных молекул), можно получить относительно ясную картину поведения системы; например , его кинетическая схема , [9] или его потенциал активности, или ее уменьшение размеров формы . [10] [11] В частности, можно построить (многие свойства) путь реакции фермента при мониторинге активности отдельного фермента.[12] Кроме того, некоторые авторы описали важные аспекты анализа данных по отдельным молекулам, такие как методы подбора и тесты для гомогенных популяций. [7] С другой стороны, есть несколько проблем с анализом данных об отдельных молекулах, включая создание среды с низким уровнем шума и изолированные наконечники пипеток, фильтрацию некоторых оставшихся нежелательных компонентов (шумов), обнаруженных в записях, и продолжительность требуется для анализа данных (предварительная обработка, однозначное обнаружение событий, построение данных, подгонка кинетических схем и т. д.).

Воздействие [ править ]

Одномолекулярные методы повлияли на оптику, электронику, биологию и химию. В биологических науках изучение белков и других сложных биологических механизмов ограничивалось ансамблевыми экспериментами, что делало почти невозможным прямое наблюдение их кинетики. Например, только после того, как для изучения пар кинезин-миозин в мышечной ткани была использована флуоресцентная микроскопия одиночных молекул, стало возможным прямое наблюдение за механизмами ходьбы. Эти эксперименты, однако, по большей части ограничивались исследованиями in vitro, поскольку полезные методы визуализации живых клеток еще не реализованы в полной мере. Перспективы визуализации одиночных молекул in vivo, [13]тем не менее, это дает огромный потенциал для непосредственного наблюдения биомолекул в природных процессах. Эти методы часто используются для исследований с участием белков с низким содержанием копий, многие из которых все еще открываются. Эти методы также были расширены для изучения областей химии, включая картографирование неоднородных поверхностей. [14]

См. Также [ править ]

  • Одномолекулярный магнит
  • Силовая спектроскопия
  • Магнитный пинцет
  • Оптический пинцет
  • Одночастичное слежение
  • Рамановская спектроскопия
  • Сканирующая зондовая микроскопия
  • Электронная микроскопия
  • Привязанное движение частиц (TPM)
  • Микроскопия сверхвысокого разрешения
  • Зажим напряжения
  • Настраиваемый резистивный датчик импульсов
  • Секвенирование отдельной молекулы в реальном времени

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Ю. Ройтер и С. Минко, Эксперименты с одиночными молекулами АСМ на границе твердое тело-жидкость: конформация адсорбированных гибких полиэлектролитных цепей in situ , Журнал Американского химического общества, вып. 127, вып. 45, стр. 15688–15689 (2005).
  2. ^ Juette, MF; Терри, DS; Вассерман, MR; Чжоу, Z; Альтман, РБ; Чжэн, Q; Бланшар, Южная Каролина (июнь 2014 г.). «Светлое будущее флюоресцентной визуализации одиночных молекул» . Curr Opin Chem Biol . 20 : 103–11. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2014.05.010 . PMC  4123530 . PMID  24956235 .
  3. ^ WE Moerner и L. Kador, Оптическое обнаружение и спектроскопия одиночных молекул в твердом теле , Phys. Rev. Lett. 62, 2535 - 2538 (1989)
  4. ^ М. Оррит и Дж. Бернар, Одиночные молекулы пентацена, обнаруженные возбуждением флуоресценции в кристалле п- терфенила , Phys. Rev. Lett. 65, 2716–2719 (1990).
  5. ^ a b D. Murugesapillai et al. , Мостик и образование петель ДНК с помощью HMO1 обеспечивает механизм стабилизации свободного от нуклеосом хроматина , Nucleic Acids Res (2014) 42 (14): 8996-9004
  6. ^ a b Murugesapillai, D .; и другие. (2016). «Одномолекулярные исследования архитектурных изгибающих белков группы B с высокой подвижностью» . Biophys Ред . 9 (1): 17–40. DOI : 10.1007 / s12551-016-0236-4 . PMC 5331113 . PMID 28303166 .  
  7. ^ a b c Б. Сакманн и Э. Нехер, Одноканальная запись , ISBN 9780306414190 (1995). 
  8. ^ О. Фломенбом, Дж. Клафтер и А. Сабо, Что можно узнать из траекторий одной молекулы с двумя состояниями? Архивировано 14 января 2012 года на Wayback Machine , Biophys. J. 88, 3780–3783 (2005) ; arXiv : q-bio / 0502006
  9. ^ Srinivasan, Бхарат (2020-10-08). «Явное лечение не Михаэлиса-Ментен и атипичной кинетики в раннем открытии лекарств» . dx.doi.org . Проверено 9 ноября 2020 .
  10. ^ О. Flomenbom и RJ Silbey, Используя содержание информации в двух государственных траекториях архивация 14 января 2012 года, на Wayback Machine , Proc. Natl. Акад. Sci. USA 103, 10907–10910 (2006) .
  11. ^ O. Flomenbom, и RJ Silbey, Набор инструментов для анализа конечных траекторий с двумя состояниями, Phys. Ред. E 78, 066105 (2008) ; arXiv: 0802.1520 .
  12. ^ О. Фломенбом, К. Велония, Д. Лоос и др., Растянутый экспоненциальный распад и корреляции в каталитической активности флуктуирующих одиночных молекул липазы. Архивировано 14 января 2012 г., в Wayback Machine , Proc. Natl. Акад. Sci. США 102, 2368–2372 (2005) .
  13. ^ Чжан, Хун; Станчаускас, Рамунас; Стиглохер, Кристиан; Дизон, Кевин К .; Жоспен, Мэлль; Бессеро, Жан-Луи; Пино, Фабьен (2014). «Визуализация одной молекулы in vivo выявляет измененную динамику кальциевых каналов у мутантных по дистрофину C. elegans» . Nature Communications . 5 : ncomms5974. Bibcode : 2014NatCo ... 5.4974Z . DOI : 10.1038 / ncomms5974 . PMC 4199201 . PMID 25232639 .  
  14. ^ Walder, R .; Nelson, N .; Шварц, ДК (2011). «Картирование поверхности сверхвысокого разрешения по траекториям молекулярных зондов» . Nature Communications . 2 : 515. Bibcode : 2011NatCo ... 2..515W . DOI : 10.1038 / ncomms1530 . PMID 22044994 .