Силовая спектроскопия - это набор методов для изучения взаимодействий и сил связывания между отдельными молекулами. [1] [2] Эти методы могут использоваться для измерения механических свойств отдельных полимерных молекул или белков или отдельных химических связей . Название «силовая спектроскопия », хотя и широко используется в научном сообществе, несколько вводит в заблуждение, потому что истинного взаимодействия вещества и излучения не существует . [3]
Методы, которые могут быть использованы для выполнения силовой спектроскопии, включают атомно-силовую микроскопию , [2] оптический пинцет , [4] магнитный пинцет , акустическую силовую спектроскопию, [5] микроиглы [6] и биомембраны. [7]
Силовая спектроскопия измеряет поведение молекулы под действием механической силы растяжения или скручивания . Таким образом, в последние годы многое было изучено о механохимическом взаимодействии ферментов, ответственных за сокращение мышц , транспорт в клетке , генерацию энергии (F1-АТФаза), репликацию и транскрипцию ДНК (полимеразы), расплетание и раскручивание ДНК ( топоизомеразы и геликазы). [ необходима цитата ]
В отличие от типичной ансамблевой спектроскопии, это метод одиночной молекулы , который позволяет исследователю определять свойства конкретной исследуемой молекулы. В частности, могут наблюдаться редкие события, такие как конформационные изменения, которые маскируются в ансамбле.
Экспериментальные техники
Есть много способов точно управлять отдельными молекулами. Среди них выделяются оптический или магнитный пинцет, кантилеверы для атомно-силового микроскопа (АСМ) и акустическая силовая спектроскопия. Во всех этих методах биомолекула, такая как белок или ДНК, или какой-либо другой биополимер, имеет один конец, связанный с поверхностью, а другой - с датчиком силы. Датчик силы обычно представляет собой бусину микрометрового размера или консоль, смещение которой можно измерить для определения силы.
Консоли для атомно-силового микроскопа
Адсорбированные на поверхности молекулы улавливаются микроскопическим наконечником (нанометровой ширины), который расположен на конце эластичного кантилевера. В более сложной версии этого эксперимента (химическая силовая микроскопия) наконечники ковалентно функционализированы с интересующими молекулами. [8] Затем пьезоэлектрический контроллер поднимает кантилевер. Если на эластичный кантилевер действует некоторая сила (например, из-за того, что какая-то молекула растягивается между поверхностью и наконечником), это будет отклоняться вверх (сила отталкивания) или вниз (сила притяжения). Согласно закону Гука это отклонение будет пропорционально силе, действующей на кантилевер. Отклонение измеряется положением лазерного луча, отраженного кантилевером. Такая установка может измерять силы до 10 пН (10 -11 Н ), предел основного разрешения определяется тепловым шумом кантилевера .
Так называемая силовая кривая - это график силы (или, точнее, отклонения кантилевера) от положения пьезоэлектрического элемента по оси Z. Идеальная пружина Гука , например, будет иметь прямую диагональную кривую силы. Обычно силовые кривые, наблюдаемые в экспериментах по силовой спектроскопии, состоят из контактной (диагональной) области, где зонд контактирует с поверхностью образца, и бесконтактной области, где зонд находится за пределами поверхности образца. Когда восстанавливающая сила кантилевера превышает силу сцепления зонда с образцом, зонд выскакивает из контакта, и величина этого скачка часто используется как мера силы сцепления или силы разрыва. В общем, разрыв связи зонд-поверхность - это случайный процесс; поэтому для надежного количественного определения силы адгезии требуется построение нескольких индивидуальных кривых силы. Гистограмма сил адгезии, полученная в результате этих множественных измерений, обеспечивает основные выходные данные для измерения силовой спектроскопии.
В биофизике силовая спектроскопия одиночных молекул может использоваться для изучения энергетического ландшафта, лежащего в основе взаимодействия двух биомолекул, таких как белки. Здесь один связывающий партнер может быть прикреплен к кончику кантилевера через гибкую линкерную молекулу (цепь ПЭГ), в то время как другой иммобилизован на поверхности субстрата. В типичном подходе кантилевер многократно приближается и отводится от образца с постоянной скоростью. В некоторых случаях происходит связывание между двумя партнерами, которое становится видимым на силовой кривой, поскольку использование гибкого линкера приводит к появлению характерной формы кривой (см. Модель червеобразной цепи ), отличной от адгезии. Собранные силы разрыва могут быть затем проанализированы как функция скорости нагружения связки. Полученный график средней разрывной силы как функции скорости нагружения называется спектром сил и формирует базовый набор данных для динамической спектроскопии сил . [9] [10]
В идеальном случае единственного резкого энергетического барьера для взаимодействий зонд-образец динамический спектр силы покажет линейное увеличение силы разрыва как функцию логарифма скорости нагружения, как описано в модели, предложенной Bell et al. [11] Здесь наклон спектра разрывной силы равен, где - расстояние от минимума энергии до переходного состояния. На сегодняшний день существует ряд теоретических моделей, описывающих взаимосвязь между скоростью нагружения и разрывной силой, основанных на различных предположениях и предсказывающих различные формы кривых. [10] [12]
Например, Ма X., Gosai A. и др. Использовали спектроскопию динамических сил наряду с моделированием молекулярной динамики, чтобы выяснить силу связывания между тромбином, белком свертывания крови и его ДНК-аптамером. [13]
Акустическая силовая спектроскопия
Недавно разработанный метод, акустическая силовая спектроскопия (AFS), позволяет управлять силой сотен одиночных молекул и одиночных ячеек параллельно, обеспечивая высокую экспериментальную производительность. [5] В этом методе пьезоэлемент резонансно возбуждает плоские акустические волны над микрожидкостным чипом. Генерируемые акустические волны способны воздействовать на микросферы с плотностью, отличной от плотности окружающей среды. Биомолекулы, такие как ДНК, РНК или белки, могут быть индивидуально привязаны между микросферами и поверхностью, а затем исследованы акустическими силами, создаваемыми пьезосенсором. Клетками можно манипулировать с помощью акустических сил напрямую или с помощью микросфер в качестве ручек. [14] С помощью устройств AFS можно прикладывать силы в диапазоне от 0 до нескольких сотен пиконьютонов на сотни микросфер и параллельно получать кривые расширения силы или гистограммы разрывных сил многих отдельных событий.
Оптический пинцет
Другой метод, который набирает популярность для экспериментов с одиночными молекулами, - это использование оптического пинцета для приложения механических сил к молекулам. Сильно сфокусированный лазерный луч способен улавливать и удерживать частицы (диэлектрического материала) в диапазоне размеров от нанометров до микрометров. Захватывающее действие оптического пинцета является результатом действия дипольной силы или силы оптического градиента, действующей на диэлектрическую сферу. Техника использования сфокусированного лазерного луча в качестве ловушки для атомов впервые была применена в 1984 году в лабораториях Bell. До этого эксперименты проводились с использованием противоположно направленных лазеров как средства захвата частиц. Более поздние эксперименты, проводившиеся в том же проекте в лабораториях Белла и других с тех пор, показали, что манипуляции с клетками без повреждений производятся с помощью инфракрасного лазера. Таким образом, была подготовлена почва для биологических экспериментов с оптическим захватом.
У каждой техники есть свои достоинства и недостатки. Например, кантилеверы AFM могут измерять миллисекундные события и силы, превышающие 10 пН. Хотя стеклянные микроволокна не могут достичь такого точного пространственного и временного разрешения, они могут измерять пиконьютонные силы. Оптический пинцет позволяет измерять пиконьютонные силы и нанометровые смещения, что является идеальным диапазоном для многих биологических экспериментов. Магнитный пинцет может измерять фемтоньютонную силу, и, кроме того, их также можно использовать для приложения кручения. Устройства AFS позволяют проводить статистический анализ механических свойств биологических систем, применяя силы пиконьютона к сотням отдельных частиц параллельно с временем отклика менее миллисекунды.
Приложения
Обычно силовая спектроскопия используется для измерения эластичности полимеров , особенно биополимеров, таких как РНК и ДНК . [15] Еще одно биофизическое приложение силовой спектроскопии полимеров - это раскрытие белков . [16] Модульные белки могут адсорбироваться на золото или (реже) слюды поверхности , а затем растягивается. Последовательное развертывание модулей наблюдается как очень характерная зубчатая диаграмма зависимости силы от удлинения; каждый зуб соответствует разворачиванию одного белкового модуля (кроме последнего, который обычно представляет собой отделение белковой молекулы от кончика). С помощью этого метода можно получить много информации об эластичности белка и его развертывании. Многие белки в живой клетке должны подвергаться механическому воздействию.
Более того, силовая спектроскопия может использоваться для исследования ферментативной активности белков, участвующих в репликации , транскрипции , организации и репарации ДНК . Это достигается путем измерения положения шарика, прикрепленного к комплексу ДНК-белок, застрявшего на веревке ДНК, один конец которой прикреплен к поверхности, при сохранении постоянной силы. Этот метод использовался, например, для изучения ингибирования элонгации транскрипции клебсидином и ацинетодином. [17]
Другое основное применение силовой спектроскопии - изучение механической стойкости химических связей. В этом случае обычно наконечник функционализирован лигандом, который связывается с другой молекулой, связанной с поверхностью. Наконечник прижимается к поверхности, обеспечивая контакт между двумя молекулами, а затем втягивается, пока вновь образованная связь не разорвется. Измеряется сила разрыва связи. Поскольку механическое разрушение - это кинетический, случайный процесс , разрывное усилие не является абсолютным параметром, а является функцией как температуры, так и скорости вытягивания. Низкие температуры и высокие скорости вытягивания соответствуют более высоким разрывным усилиям. Путем тщательного анализа разрушающей силы при различных скоростях вытягивания можно составить карту энергетического ландшафта химической связи под действием механической силы. [18] Это приводит к интересным результатам в исследовании антитела - антиген , белок-белок, взаимодействие клеток белка-живой и улов облигаций . [19]
Недавно этот метод был использован в клеточной биологии для измерения совокупных стохастических сил, создаваемых моторными белками, которые влияют на движение частиц в цитоплазме. Таким образом, микроскопия силового спектра может быть использована для лучшего понимания многих клеточных процессов, которые требуют движения частиц внутри цитоплазмы. [20]
Рекомендации
- ^ Нойман, Кейр C; Надь, Аттила (29 мая 2008 г.). «Одномолекулярная силовая спектроскопия: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия» . Методы природы . 5 (6): 491–505. DOI : 10.1038 / nmeth.1218 . PMC 3397402 . PMID 18511917 .
- ^ а б Хоффманн, Тони; Дуган, Лорна (2012). «Силовая спектроскопия одиночных молекул с использованием полипротеинов». Обзоры химического общества . 41 (14): 4781–96. DOI : 10.1039 / c2cs35033e . PMID 22648310 .
- ^ Анна Рита Биззарри; Сальваторе Каннистраро (25 января 2012 г.). Спектроскопия динамических сил и распознавание биомолекул . CRC Press . стр. 1–. ISBN 978-1-4398-6237-7.
- ^ Джаганнатан, Бхарат; Маркиз, Сьюзен (ноябрь 2013 г.). «Сворачивание и разворачивание белка под действием силы» . Биополимеры . 99 (11): 860–869. DOI : 10.1002 / bip.22321 . PMC 4065244 . PMID 23784721 .
- ^ а б Ситтерс, Геррит; Камсма, Доуве; Талхаммер, Грегор; Ритч-Марте, Моника; Петерман, Эрвин Дж. Г.; Wuite, Gijs JL (24 ноября 2014 г.). «Акустическая силовая спектроскопия». Методы природы . 12 (1): 47–50. DOI : 10.1038 / nmeth.3183 . PMID 25419961 . S2CID 12886472 .
- ^ Кишино, Акиёси; Янагида, Тошио (июль 1988 г.). «Измерения силы путем микроманипуляции одной нити актина стеклянными иглами». Природа . 334 (6177): 74–76. Bibcode : 1988Natur.334 ... 74K . DOI : 10.1038 / 334074a0 . PMID 3386748 . S2CID 4274023 .
- ^ Evans, E .; Ritchie, K .; Меркель, Р. (июнь 1995 г.). «Метод чувствительной силы для исследования молекулярной адгезии и структурных связей на биологических границах раздела» . Биофизический журнал . 68 (6): 2580–2587. Bibcode : 1995BpJ .... 68.2580E . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (95) 80441-8 . PMC 1282168 . PMID 7647261 .
- ^ Отт, Вольфганг; Йобст, Маркус А .; Шулер, Константин; Gaub, Hermann E .; Нэш, Майкл А. (январь 2017 г.). "Одномолекулярная силовая спектроскопия полипротеинов и комплексов рецептор-лиганд: Текущий инструментарий". Журнал структурной биологии . 197 (1): 3–12. DOI : 10.1016 / j.jsb.2016.02.011 . PMID 26873782 .
- ^ Бхушан, Бхарат (2017). Справочник Springer по нанотехнологиям . ISBN 9783662543573. OCLC 1012104482 .[ требуется страница ]
- ^ а б Хинтердорфер, Питер; Ван Ойен, Антуан (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул . Springer. ISBN 9780387764979. OCLC 534951120 .[ требуется страница ]
- ^ Белл, Г. (12 мая 1978 г.). «Модели специфической адгезии клеток к клеткам». Наука . 200 (4342): 618–627. Bibcode : 1978Sci ... 200..618B . DOI : 10.1126 / science.347575 . PMID 347575 .
- ^ Петросян, Р. (2020). «Определение разворачивающей силы и единая модель зависимости средней разворачивающей силы от скорости нагружения» . J. Stat. Мех . 2020 (33201): 033201. DOI : 10,1088 / 1742-5468 / ab6a05 .
- ^ Ма, Сяо; Госай, Агниво; Баласубраманян, Ганеш; Шротрия, Пранав (май 2019 г.). «Силовая спектроскопия взаимодействия тромбин-аптамер: сравнение экспериментов АСМ и моделирования молекулярной динамики». Прикладная наука о поверхности . 475 : 462–472. Bibcode : 2019ApSS..475..462M . DOI : 10.1016 / j.apsusc.2019.01.004 .
- ^ Соркин, Рая; Бергамаски, Джулия; Камсма, Доуве; Бренд, парень; Декель, Эля; Офир-Бирин, Йифат; Рудик, Ариэль; Жиронелла, Марта; Риторт, Феликс; Регев-Рудски, Нета; Roos, Wouter H .; Wuite, Gijs JL; Дишер, Деннис (8 августа 2018 г.). «Зондирование клеточной механики с акустической силовой спектроскопией» . Молекулярная биология клетки . 29 (16): 2005–2011. DOI : 10,1091 / mbc.E18-03-0154 . PMC 6232971 . PMID 29927358 .
- ^ Уильямс, Марк С; Рузина, Юлия (01.06.2002). «Силовая спектроскопия одиночных молекул ДНК и РНК» . Текущее мнение в структурной биологии . 12 (3): 330–336. DOI : 10.1016 / S0959-440X (02) 00340-8 . ISSN 0959-440X . PMID 12127451 .
- ^ Jagannathan, B .; Elms, PJ; Bustamante, C .; Маркиз, С. (4 сентября 2012 г.). «Прямое наблюдение индуцированного силой переключения в анизотропном механическом пути разворачивания белка» . Труды Национальной академии наук . 109 (44): 17820–17825. Bibcode : 2012PNAS..10917820J . DOI : 10.1073 / pnas.1201800109 . PMC 3497811 . PMID 22949695 .
- ^ Метелев Михаил; Арсеньев, Анатолий; Бушин, Лия Б .; Кузнеделов, Константин; Артамонова, Татьяна Олеговна; Кондратенко, Руслан; Ходорковский Михаил; Seyedsayamdost, Mohammad R .; Северинов, Константин (3 февраля 2017 г.). «Ацинетодин и клебсидин, РНК-полимераза, нацеленная на пептиды лассо, продуцируемые человеческими изолятами Acinetobacter gyllenbergii и Klebsiella pneumoniae». ACS Химическая биология . 12 (3): 814–824. DOI : 10.1021 / acschembio.6b01154 . PMID 28106375 .
- ^ Merkel, R .; Nassoy, P .; Leung, A .; Ritchie, K .; Эванс, Э. (январь 1999 г.). «Энергетические ландшафты связей рецептор-лиганд исследованы с помощью динамической силовой спектроскопии» . Природа . 397 (6714): 50–53. DOI : 10.1038 / 16219 . ISSN 1476-4687 . PMID 9892352 . S2CID 4419330 .
- ^ Шулер, Константин; Малиновска, Клара Х .; Бернарди, Рафаэль С .; Миллес, Лукас Ф .; Йобст, Маркус А .; Дурнер, Эллис; Отт, Вольфганг; Жареный, Даниэль Б .; Байер, Эдвард А .; Шультен, Клаус; Gaub, Hermann E .; Нэш, Майкл А. (8 декабря 2014 г.). «Ультрастабильный адгезионно-целлюлозный комплекс затягивается под нагрузкой» . Nature Communications . 5 (1): 5635. Bibcode : 2014NatCo ... 5E5635S . DOI : 10.1038 / ncomms6635 . PMC 4266597 . PMID 25482395 .
- ^ Го, Мин; Ehrlicher, Allen J .; Jensen, Mikkel H .; Ренц, Мальте; Мур, Джеффри Р .; Голдман, Роберт Д .; Липпинкотт-Шварц, Дженнифер; Mackintosh, Frederick C .; Вайц, Дэвид А. (август 2014 г.). «Исследование стохастических, двигательных свойств цитоплазмы с помощью микроскопии спектра силы» . Cell . 158 (4): 822–832. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.06.051 . PMC 4183065 . PMID 25126787 .
Библиография
- Hugel, T; Зейтц, М. (2001). «Изучение молекулярных взаимодействий методом силовой спектроскопии АСМ». Macromol Rapid Commun . 22 (13): 989–1016. DOI : 10.1002 / 1521-3927 (20010901) 22:13 <989 :: помощь-marc989> 3.0.co; 2-й .
- Яншофф, А; Neitzert, M; Обердорфер, Y; Fuchs, H (2000). «Силовая спектроскопия молекулярных систем - спектроскопия одиночных молекул полимеров и биомолекул». Angew Chem Int Ed . 39 (18): 3212–3237. DOI : 10.1002 / 1521-3773 (20000915) 39:18 <3212 :: помощь-anie3212> 3.0.co; 2-х . PMID 11028062 .
- Oesterhelt, F .; Rief, M .; Гауб, HE (1999). «Спектроскопия одиночных молекул с помощью АСМ указывает на спиральную структуру полиэтиленгликоля в воде» . New J. Phys . 1 (6): 1. Bibcode : 1999NJPh .... 1 .... 6O . DOI : 10.1088 / 1367-2630 / 1/1/006 .
- Rief, M .; Грубмюллер, Х. (2001). «Силовая спектроскопия одиночных биомолекул». ХимФисХим . 57 : 255–261. PMID 12503171 .
- Smith, S .; Cui, Y .; Bustamante, C. Science (Вашингтон, округ Колумбия), 1996; 271: 795.
- Zhang, WK; Чжан, X (2003). «Одномолекулярная механохимия макромолекул». Prog Polym Sci . 28 (8): 1271–1295. DOI : 10.1016 / s0079-6700 (03) 00046-7 .
- Jagannathan, B .; Марки, С. (2013). «Сворачивание и разворачивание белков под действием силы» . Биополимеры . 99 (11): 860–869. DOI : 10.1002 / bip.22321 . PMC 4065244 . PMID 23784721 .