Синхронный коэффициент изменения лобового сопротивления

Покадровая последовательность, показывающая, что окрашенная SYBR Green I ДНК pUC19 (2,7 т.п.н.) является SCODA, сконцентрированной в центре 1% агарозного геля (где нет электрода).

Синхронный коэффициент изменения сопротивления ( SCODA ) - это биотехнологический метод очистки, разделения и / или концентрирования биомолекул. SCODA обладает способностью разделять молекулы, подвижность (или сопротивление) которых может изменяться синхронно с движущим полем. Этот метод в основном использовался для концентрирования и очистки ДНК , где подвижность ДНК изменяется с приложенным электрофоретическим полем. ^{[1] [2] [3]} Электрофоретический SCODA также был продемонстрирован с РНК и белками .

Теория [ править ]

Как показано ниже, принцип SCODA применяется к любой частице, управляемой силовым полем, в котором подвижность частицы изменяется синхронно с движущим полем.

Принцип SCODA [ править ]

Для пояснения рассмотрим электрофоретическую частицу, движущуюся (ведомую) в электрическом поле. Позволять:

${\ displaystyle E = {\ widehat {E}} E_ {0} cos (\ omega t)}$ (1)

и${\ displaystyle dv_ {x_ {cos2 \ omega}}}$

${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=\mu cos(\omega t){\widehat {E}}E_{0}}$ (2)

обозначают электрическое поле и скорость частицы в таком поле. Если постоянно, то среднее значение по времени .${\displaystyle \mu }$${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=0}$

If не является константой как функция времени, и if имеет частотную составляющую, пропорциональную среднему времени, не обязательно равным нулю.${\displaystyle \mu }$${\displaystyle \mu }$${\displaystyle cos(\omega t)}$${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)}$

Рассмотрим следующий пример:

${\displaystyle \mu (t)=\mu _{0}+\mu _{1}cos(\omega t)}$ (3)

Подставляя (3) в (2) и вычисляя среднее по времени , получаем:${\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}}$

${\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}={\frac {1}{2}}\mu _{1}{\widehat {E}}E_{0}}$ (4)

Таким образом, возможно, чтобы частица испытывала ненулевую среднюю по времени скорость, другими словами, чистый электрофоретический дрейф, даже когда среднее по времени приложенное электрическое поле равно нулю.

Создание геометрии поля фокусировки [ править ]

Рассмотрим частицу в силовом поле, которое имеет скорость, параллельную направлению поля, и скорость, пропорциональную квадрату величины электрического поля (можно использовать любую другую нелинейность ^[1] ):

${\displaystyle {\overrightarrow {v}}=k{\widehat {E}}(E)^{2}}$ (5)

Эффективная подвижность частицы (соотношение между небольшими изменениями скорости дрейфа и небольшими изменениями электрического поля ) может быть выражена в декартовых координатах как:${\displaystyle d{\overrightarrow {v}}}$${\displaystyle d{\overrightarrow {E}}}$

${\displaystyle dv_{x}={\partial v_{x} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{x} \over \partial E_{y}}dE_{y}}$ (6)

${\displaystyle dv_{y}={\partial v_{y} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{y} \over \partial E_{y}}dE_{y}}$ (7)

Комбинируя (5), (6) и (7), получаем:

${\displaystyle dv_{x}=k{\Biggl [}{\Biggl (}E+{\frac {E_{x}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}}$ (8)

${\displaystyle dv_{y}=k{\Biggl [}{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}E+{\frac {E_{y}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}}$ (9)

Далее рассмотрим, что поле E приложено в плоскости и вращается против часовой стрелки с угловой частотой , так что компоненты поля равны:${\displaystyle \omega }$

${\displaystyle E_{x}=Ecos(\omega t)}$ (10)

${\displaystyle E_{y}=Esin(\omega t)}$ (11)

Подстановка (10) и (11) в (8) и (9) и упрощение с использованием тригонометрических тождеств приводит к сумме постоянных членов, синуса и косинуса, на угловой частоте . Следующие вычисления будут выполнены таким образом, что только члены косинуса на угловой частоте дадут ненулевую чистую скорость дрейфа - поэтому нам нужно только оценить эти члены, которые будут сокращены и . Получается следующее:${\displaystyle 2\omega }$${\displaystyle 2\omega }$${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}}$${\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}}$

${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{x}}$ (12)

${\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{y}}$ (13)

Пусть и принимает форму небольшого квадрупольного поля напряженности, которое изменяется синусоидальным образом пропорционально такому, что:${\displaystyle dE_{x}}$${\displaystyle dE_{y}}$${\displaystyle dE_{q}}$${\displaystyle cos(2\omega t)}$

${\displaystyle dE_{x}=-dE_{q}xcos(\omega t)}$ (14)

${\displaystyle dE_{y}=dE_{q}ycos(\omega t)}$ (15)

Подставляя (14) и (15) в (12) и (13) и принимая среднее значение по времени, получаем:

${\displaystyle {\bar {dv_{x}}}={\bar {dv_{x_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}x}$ (16)

${\displaystyle {\bar {dv_{y}}}={\bar {dv_{y_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}y}$ (17)

что можно резюмировать в векторной записи:

${\displaystyle {\bar {d{\overrightarrow {v}}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}{\overrightarrow {r}}}$ (18)

Уравнение (18) показывает, что для всех положений усредненная по времени скорость соответствует направлению к началу координат (концентрация частиц к началу координат) со скоростью, пропорциональной коэффициенту подвижности k, напряженности вращающегося поля E и напряженности возмущающее квадрупольное поле .${\displaystyle {\overrightarrow {r}}}$${\displaystyle dE_{q}}$

Концентрация и очистка ДНК [ править ]

Концентрация ДНК SCODA с использованием системы Aurora. А - инъекция образца ДНК. Б, В, Г - очистка образца ДНК. На изображении D ДНК достигает положения равновесия между концентрирующей силой SCODA и полем промывки постоянного тока. E - ориентированный образец ДНК, готовый к пипетке из центральной лунки для экстракции.

Молекулы ДНК уникальны тем, что они представляют собой длинные заряженные полимеры, которые в разделяющей среде, такой как агарозный гель , могут проявлять сильно нелинейные профили скорости в ответ на электрическое поле. Таким образом, ДНК легко отделяется от других молекул, которые не являются одновременно заряженными и сильно нелинейными, с помощью SCODA ^[2]

Инъекция ДНК [ править ]

Чтобы выполнить концентрацию молекул ДНК SCODA, образец должен быть заключен в разделительную среду (гель) в местах, где электрофоретическое поле имеет оптимальную интенсивность. Это первоначальное перемещение образца в положение оптимальной концентрации называется «инъекцией». Оптимальное положение определяется геометрией геля и расположением приводных электродов SCODA. Первоначально образец находится в буферном растворе в камере для образцов, рядом с концентрационным гелем. Инъекция достигается приложением контролируемого электрофоретического поля постоянного тока через камеру для образца, в результате чего все заряженные частицы переносятся в концентрирующий гель. Для получения хорошей укладки образца (т.е. плотной полосы ДНК) можно использовать несколько методов.Одним из примеров является использование отношения проводимости между буфером камеры для образцов и буфером концентрационного геля. Если буфер камеры для образцов имеет низкую проводимость, а буфер концентрирующего геля имеет высокую проводимость, это приводит к резкому падению электрического поля на границе раздела гель-буфер, что способствует накоплению.

Концентрация ДНК [ править ]

После того, как ДНК оптимально расположена в концентрационном геле, применяются вращающиеся поля SCODA. Частоту полей можно настроить так, чтобы концентрировались только определенные длины ДНК. Для предотвращения кипения во время стадии концентрирования из-за джоулева нагрева разделяющая среда может активно охлаждаться. Также возможно обратить фазу полей SCODA, так что молекулы расфокусируются.

Очистка ДНК [ править ]

Поскольку только частицы, которые демонстрируют нелинейную скорость, испытывают концентрирующую силу SCODA, небольшие заряженные частицы, которые линейно реагируют на электрофоретические поля, не концентрируются. Эти частицы вместо спирали движутся к центру орбиты геля SCODA с постоянным радиусом. Если на вращающиеся поля SCODA накладывается слабое поле постоянного тока, эти частицы будут «смыты» с геля SCODA, в результате чего высокочистая ДНК останется в центре геля.

Извлечение ДНК [ править ]

Сила ДНК SCODA приводит к тому, что образец ДНК концентрируется в центре геля SCODA. Для экстракции ДНК в геле можно предварительно сформировать лунку для экстракции и заполнить ее буфером. Поскольку ДНК не проявляет нелинейной подвижности в буфере, она накапливается в лунке для экстракции. В конце стадии концентрирования и очистки образец может быть перенесен из этой лунки.

Приложения [ править ]

A - сильно загрязненный образец перед введением в гель SCODA. Б - гель SCODA после инъекции. C - гель SCODA в процессе очистки. D - гель SCODA в конце процесса очистки (без видимых загрязнений). E - Флуоресцентное изображение геля SCODA из рисунка D, показывающее окрашенную ДНК в центре геля SCODA.

Очистка высокомолекулярной ДНК [ править ]

Электрофоретическая сила SCODA достаточно мягкая, чтобы поддерживать целостность высокомолекулярной ДНК, поскольку она концентрируется по направлению к центру геля SCODA. В зависимости от длины ДНК в образце можно использовать разные протоколы для концентрирования ДНК длиной более 1 МБ.

Очистка загрязненной ДНК [ править ]

Концентрация и очистка ДНК были достигнуты непосредственно из образцов битуминозных песков, ресуспендированных в буфере, с использованием метода SCODA. Впоследствии было проведено секвенирование ДНК и было идентифицировано более 200 различных бактериальных геномов. ^{[2] [4]} SCODA также использовалась для очистки ДНК из многих других источников окружающей среды. ^{[5] [6]}

В зависимости от последовательности [ править ]

Мутантная ДНК (зеленая) отделяется от ДНК дикого типа (красная) во время специфичной для последовательности SCODA.

Нелинейную подвижность ДНК в геле можно дополнительно контролировать путем встраивания в гель SCODA ДНК- олигонуклеотидов, комплементарных фрагментам ДНК в образце. ^{[7] [8]} Это приводит к высокоспецифическим нелинейным скоростям для образца ДНК, который соответствует ДНК, внедренной в гель. Эта искусственная специфическая нелинейность затем используется для выборочного концентрирования только представляющих интерес последовательностей, отклоняя при этом все другие последовательности ДНК в образце. Было продемонстрировано более чем 1000000-кратное обогащение однонуклеотидных вариантов по сравнению с диким типом.

Применение этого метода - обнаружение редкой ДНК опухолевого происхождения ( цДНК ) в образцах крови. ^[9]

См. Также [ править ]

• Извлечение ДНК
• Осаждение этанолом
• Фенол-хлороформная экстракция
• Очистка на спин-колонке

Ссылки [ править ]