Слитые белки или химерные (kī-ˈmir-ik) белки (буквально, состоящие из частей из разных источников) - это белки, созданные путем соединения двух или более генов, которые изначально кодировали отдельные белки. Трансляция этого гибридного гена приводит к одному или нескольким полипептидам с функциональными свойствами, полученными из каждого из исходных белков. Рекомбинантные слитые белки создаются искусственно с помощью технологии рекомбинантных ДНК для использования в биологических исследованиях или терапии . Химеры или химеры обычно обозначают гибридные белки, состоящие из полипептидов.имеющие разные функции или физико-химические структуры. Химерные мутантные белки возникают в природе, когда сложная мутация , такая как хромосомная транслокация , тандемная дупликация или ретротранспозиция, создает новую кодирующую последовательность, содержащую части кодирующих последовательностей из двух разных генов. Встречающиеся в природе слитые белки обычно обнаруживаются в раковых клетках, где они могут функционировать как онкобелки . BCR-ABL слитый белок представляет собой хорошо известный пример онкогенного слитого белка, и считается основным фактором онкогенными хронического миелолейкоза .
Функции [ править ]
Некоторые гибридные белки объединяют целые пептиды и, следовательно, содержат все функциональные домены исходных белков. Однако другие слитые белки, особенно те, которые встречаются в природе, объединяют только части кодирующих последовательностей и, следовательно, не поддерживают исходные функции родительских генов, которые их сформировали.
Многие слияния целых генов полностью функциональны и могут заменять исходные пептиды. Некоторые, однако, испытывают взаимодействия между двумя белками, которые могут изменять их функции. Помимо этих эффектов, некоторые слияния генов могут вызывать регуляторные изменения, которые изменяют, когда и где действуют эти гены. Для частичного слияния генов перетасовка различных активных сайтов и связывающих доменов может привести к появлению новых белков с новыми функциями.
Флуоресцентные белковые метки [ править ]
Слияние флуоресцентных меток с белками в клетке-хозяине - широко популярный метод, используемый в экспериментальных клеточных и биологических исследованиях для отслеживания взаимодействия белков в режиме реального времени. Первая флуоресцентная метка, зеленый флуоресцентный белок (GFP), была выделена из Aequorea Victoria и до сих пор часто используется в современных исследованиях. Более поздние производные включают фотопреобразованные флуоресцентные белки (PCFP), которые впервые были выделены из Anthozoa . Наиболее часто используемый PCFP - Kaedeфлуоресцентная метка, но разработка зелено-красного Kikume (KikGR) в 2005 году предлагает более яркий сигнал и более эффективное фотопреобразование. Преимущество использования флуоресцентных меток PCFP заключается в возможности отслеживать взаимодействие перекрывающихся биохимических путей в режиме реального времени. Метка изменит цвет с зеленого на красный, как только белок достигнет интересующей точки пути, и за другим окрашенным белком можно будет следить на протяжении всего пути. Этот метод особенно полезен при изучении путей рециклинга рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Судьба переработанных рецепторов G-белка может быть отправлена на плазматическую мембрану для повторного использования, отмечена зеленой флуоресцентной меткой, или может быть отправлена в лизосому.для деградации отмечен красной флуоресцентной меткой. [1]
Химерные белковые препараты [ править ]
Целью создания гибридных белков при разработке лекарств является придание свойств каждого из «родительских» белков полученному химерному белку. В настоящее время для медицинского применения доступны несколько химерных белковых препаратов .
Многие химерные белковые препараты представляют собой моноклональные антитела , специфичность которых в отношении целевой молекулы была разработана с использованием мышей и, следовательно, изначально были «мышиными» антителами. Будучи нечеловеческими белками, мышиные антитела, как правило, вызывают иммунную реакцию при введении человеку. Процесс химеризации включает инженерные замены сегментов молекулы антитела , которые отличают его от человеческого антитела. Например, могут быть введены человеческие константные домены , тем самым устраняя большинство потенциально иммуногенных частей лекарственного средства без изменения его специфичности в отношении намеченной терапевтической мишени. Номенклатура антителуказывает этот тип модификации, вставляя -xi- в непатентованное имя (например, abci- xi -mab ). Если части вариабельных доменов также заменяются человеческими частями, получают гуманизированные антитела. Хотя концептуально не отличается от химер, этот тип обозначается с помощью -zu-, например, dacli- zu -mab . Дополнительные примеры см. В списке моноклональных антител .
Помимо химерных и гуманизированных антител, существуют другие фармацевтические цели для создания химерных конструкций. Этанерцепт , например, представляет собой TNF - alpha блокатор создается с помощью комбинации фактора некроза опухоли рецепторов (TNFR) с иммуноглобулином G 1 Fc сегментом . TNFR обеспечивает специфичность в отношении мишени для лекарственного средства, а Fc-сегмент антитела, как полагают, увеличивает стабильность и доставляемость лекарственного средства. [2] Дополнительные химерные белки, используемые для терапевтического применения, включают:
- Афлиберцепт : человеческий рекомбинантный белок, который помогает в лечении резистентного к оксалиплатину метастатического колоректального рака , ново-сосудистой дегенерации желтого пятна и отека желтого пятна . [2]
- Рилонацепт : уменьшает воспаление, предотвращая активацию рецепторов IL-1 для лечения криопирин-связанных периодических синдромов (CAPS). [2]
- Алефацепт : регулирует Т-клеточные ответы путем избирательного воздействия на эффекторные Т-клетки памяти для лечения вульгарного псориаза . [2]
- Ромиплостим : пептидное антитело, которое лечит иммунную тромбоцитопению . [2]
- Абатацепт / Белатасепт : препятствует костимуляции Т-лимфоцитов при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит , псориатический артрит и псориаз . [2]
- Денилейкин-дифтитокс : лечит кожную лимфому . [2]
Рекомбинантная технология [ править ]
Рекомбинантный слитый белок представляет собой белка , созданные с помощью генной инженерии гена слияния. Обычно это включает удаление стоп- кодона из последовательности кДНК , кодирующей первый белок, затем добавление последовательности кДНК второго белка в рамку считывания посредством лигирования или ПЦР с удлинением перекрытия . Эта ДНК - последовательность , затем будет выражена с помощью ячейки в качестве одного белка. Белок может быть сконструирован таким образом, чтобы включать полную последовательность обоих исходных белков или только часть каждого из них.
Если эти два объекта являются белками, часто также добавляются линкерные (или «спейсерные») пептиды, что повышает вероятность того, что белки сворачиваются независимо и ведут себя так, как ожидалось. Особенно в случае, когда линкеры позволяют очищать белок , линкеры в слитых белках или пептидах иногда конструируют с сайтами расщепления для протеаз или химических агентов, которые обеспечивают высвобождение двух отдельных белков. Этот метод часто используется для идентификации и очистки белков путем слияния белка GST , пептида FLAG или гекса- His- пептида (6xHis-tag), который можно выделить с помощью аффинной хроматографии с никелевой или кобальтовой смолой. Ди- или мультимерные химерные белки могут быть получены посредствомгенная инженерия путем слияния с исходными белками пептидных доменов, которые индуцируют искусственную ди- или мультимеризацию белков (например, стрептавидин или лейциновые молнии ). Слитые белки также могут быть произведены с присоединенными к ним токсинами или антителами для изучения развития болезни. Промотор гидрогеназы, P SH , был изучен путем конструирования слияния промотор P SH и gfp с использованием репортерного гена зеленого флуоресцентного белка ( gfp) . [3]
Рекомбинантная функциональность [ править ]
Новые рекомбинантные технологии позволили улучшить дизайн слитых белков для использования в таких разнообразных областях, как биодетекция, бумажная и пищевая промышленность, а также биофармацевтические препараты. Недавние усовершенствования включают слияние отдельных пептидов или фрагментов белка с областями существующих белков, такими как N- и C-концы , и, как известно, усиливают следующие свойства: [4]
- Каталитическая эффективность : слияние определенных пептидов позволяет повысить каталитическую эффективность за счет изменения третичной и четвертичной структуры целевого белка. [4]
- Растворимость : Общей проблемой при разработке слитых белков является проблема нерастворимости вновь синтезированных слитых белков в рекомбинантном хозяине, что приводит к чрезмерной агрегации целевого белка в клетке. Могут быть добавлены молекулярные шапероны , которые могут способствовать сворачиванию белка, тем самым улучшая разделение гидрофобных и гидрофильных взаимодействий в растворенном веществе для увеличения растворимости белка. [4]
- Термостабильность : отдельные пептиды или фрагменты белка обычно добавляют для уменьшения гибкости N- или C-конца целевого белка, что усиливает термостабильность и стабилизирует диапазон pH . [4]
- Активность фермента: слияние, которое включает введение водородных связей, можно использовать для увеличения общей активности фермента. [4]
- Уровни экспрессии: Добавление многочисленных слитых фрагментов, таких как белок, связывающий мальтозу (MBP) или небольшую убиквитиноподобную молекулу ( SUMO ), служит для усиления экспрессии фермента и секреции целевого белка. [4]
- Иммобилизация: PHA-синтаза, фермент, который позволяет иммобилизовать интересующие белки, является важной меткой слияния в промышленных исследованиях. [4]
- Качество кристаллов: качество кристаллов можно улучшить, добавив ковалентные связи между белками, что поможет в методах определения структуры. [4]
Дизайн рекомбинантных белков [ править ]
Самые ранние применения дизайна рекомбинантных белков могут быть задокументированы при использовании одиночных пептидных меток для очистки белков в аффинной хроматографии . С тех пор было разработано множество методов конструирования слитых белков для таких разнообразных приложений, как флуоресцентные белковые метки для рекомбинантных лекарственных препаратов слитых белков. Три часто используемых метода конструирования включают тандемное слияние, вставку домена и посттрансляционную конъюгацию. [5]
Тандемное слияние [ править ]
Представляющие интерес белки просто соединяются встык путем слияния N- или C-концов между белками. Это обеспечивает гибкую перемычку, обеспечивающую достаточное пространство между партнерами по сварке для обеспечения надлежащего складывания . Однако N- или C-концы пептида часто являются решающими компонентами в получении желаемой картины укладки рекомбинантного белка, что делает простое сквозное соединение доменов неэффективным в этом случае. По этой причине часто требуется белковый линкер для поддержания функциональности интересующих белковых доменов. [5]
Вставка домена [ править ]
Этот метод включает слияние последовательных белковых доменов путем кодирования желаемых структур в единую полипептидную цепь, но иногда может потребоваться встраивание домена в другой домен. Этот метод обычно считается более сложным для выполнения, чем тандемное слияние, из-за трудности поиска подходящего сайта лигирования в интересующем гене. [5]
Посттрансляционное спряжение [ править ]
Этот метод сливает белковые домены после рибосомной трансляции интересующих белков, в отличие от генетического слияния до трансляции, используемого в других рекомбинантных технологиях. [5]
Белковые линкеры [ править ]
Белковые линкеры способствуют конструированию слитых белков, обеспечивая соответствующее расстояние между доменами, поддерживая правильную укладку белка в том случае, если взаимодействия N или C-концов имеют решающее значение для укладки. Обычно белковые линкеры допускают важные доменные взаимодействия, усиливают стабильность и уменьшают стерические затруднения, что делает их предпочтительными для использования в дизайне слитых белков, даже когда N- и C-концы могут быть слиты. Три основных типа линкеров - гибкие, жесткие и расщепляемые in vivo. [5] [6]
- Гибкие линкеры могут состоять из множества небольших остатков глицина , что придает им способность сворачиваться в динамическую адаптируемую форму. [6]
- Жесткие линкеры могут быть образованы из больших циклических остатков пролина , что может быть полезно, когда необходимо поддерживать высокоспецифичное расстояние между доменами. [6]
- Расщепляемые in vivo линкеры уникальны тем, что они предназначены для высвобождения одного или нескольких слитых доменов в определенных условиях реакции, таких как определенный градиент pH , или при контакте с другой биомолекулой в клетке. [6]
Естественное явление [ править ]
Встречающиеся в природе гены слияния чаще всего создаются, когда хромосомная транслокация заменяет концевые экзоны одного гена интактными экзонами второго гена. Это создает единственный ген, который можно транскрибировать , сплайсировать и транслировать для получения функционального слитого белка. Многие важные онкогены, способствующие развитию рака, представляют собой гибридные гены, полученные таким образом.
Примеры включают:
- Слитый белок Gag-onc
- Слитый белок bcr-abl
- Слитый белок tpr-met
Антитела представляют собой слитые белки , полученные с помощью V (D) J рекомбинации .
Есть также редкие примеры встречающихся в природе полипептидов, которые кажутся слиянием двух четко определенных модулей, в которых каждый модуль демонстрирует свою характерную активность или функцию независимо от другого. Двумя основными примерами являются: двойная химера PP2C в Plasmodium falciparum (малярийный паразит), в котором каждый модуль PP2C проявляет ферментативную активность протеинфосфатазы 2C [7], и иммунофилины двойного семейства, которые встречаются у ряда одноклеточных организмов (таких как простейшие parasites и Flavobacteria) и содержат полноразмерные шаперонные модули Cyclophilin и FKBP. [8] [9] Эволюционное происхождение таких химер остается неясным.
См. Также [ править ]
- Генная инженерия
- Белковая инженерия
Ссылки [ править ]
- ^ Шмидта А, Визнер В, Schülein R, Teichmann А (2014). Использование Kaede и Kikume Green-Red Fusions для визуализации живых клеток рецепторов, связанных с G-белком . Методы молекулярной биологии. 1174 . Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press. С. 139–156. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-0944-5_9 . ISBN 9781493909438. PMID 24947379 .
- ^ Б с д е е г Baldo BA (май 2015 г.). «Химерные гибридные белки, используемые для терапии: показания, механизмы и безопасность». Безопасность лекарств . 38 (5): 455–79. DOI : 10.1007 / s40264-015-0285-9 . PMID 25832756 .
- ^ Jugder BE, Велч Дж, Braidy Н, маркиза СР (2016-07-26). «Создание и использование слияния растворимого промотора гидрогеназы (PSH) Cupriavidus necator H16 с gfp (зеленый флуоресцентный белок)» . PeerJ . 4 : e2269. DOI : 10,7717 / peerj.2269 . PMC 4974937 . PMID 27547572 .
- ^ a b c d e f g h Ян Х., Лю Л., Сюй Ф. (октябрь 2016 г.). «Перспективы и проблемы слитых конструкций в биохимии и энзимологии белков». Прикладная микробиология и биотехнология . 100 (19): 8273–81. DOI : 10.1007 / s00253-016-7795-у . PMID 27541749 .
- ↑ a b c d e Yu K, Liu C, Kim BG, Lee DY (01.01.2015). «Синтетический гибридный белок и приложения». Достижения биотехнологии . 33 (1): 155–164. DOI : 10.1016 / j.biotechadv.2014.11.005 . PMID 25450191 .
- ^ a b c d Чен X, Заро Дж. Л., Шен В. К. (октябрь 2013 г.). «Линкеры слитых белков: свойства, конструкция и функциональность» . Расширенные обзоры доставки лекарств . 65 (10): 1357–69. DOI : 10.1016 / j.addr.2012.09.039 . PMC 3726540 . PMID 23026637 .
- ^ Мамун CB, Sullivan DJ, Банерджи R, Goldberg DE (май 1998). «Идентификация и характеристика необычной двойной серин / треониновой протеинфосфатазы 2C у малярийного паразита Plasmodium falciparum» . Журнал биологической химии . 273 (18): 11241–7. DOI : 10.1074 / jbc.273.18.11241 . PMID 9556615 .
- ↑ Адамс Б., Мусиенко А., Кумар Р., Барик С. (июль 2005 г.). «Новый класс иммунофилинов двойного семейства» . Журнал биологической химии . 280 (26): 24308–14. DOI : 10.1074 / jbc.M500990200 . PMC 2270415 . PMID 15845546 .
- ^ Barik S (ноябрь 2017). «О роли, экологии, филогении и структуре двусемейных иммунофилинов» . Клеточный стресс и шапероны . 22 (6): 833–845. DOI : 10.1007 / s12192-017-0813-х . PMC 5655371 . PMID 28567569 .
Внешние ссылки [ править ]
| Библиотечные ресурсы о Fusion Protein |
|
- Мутант + химерный + белок в предметных рубриках медицинской тематики Национальной медицинской библиотеки США (MeSH)
- ChiPPI : Серверное белок- белковое взаимодействие химерных белков.
