Колоночная хроматография в химии - это метод хроматографии, используемый для выделения одного химического соединения из смеси. Хроматография способна разделять вещества на основе дифференциальной адсорбции соединений на адсорбенте; соединения перемещаются по колонке с разной скоростью, что позволяет разделить их на фракции. Этот метод широко применим, поскольку можно использовать множество различных адсорбентов (нормальная фаза, обращенная фаза или другие) с широким диапазоном растворителей. Методика может использоваться в весах от микрограммов до килограммов. Основное преимущество колоночной хроматографии - относительно невысокая стоимость и возможность одноразового использования стационарной фазы.используется в процессе. Последний предотвращает перекрестное загрязнение и деградацию стационарной фазы из-за повторного использования. Колоночная хроматография может быть проведена с использованием силы тяжести для перемещения растворителя или с использованием сжатого газа для проталкивания растворителя через колонку.
Тонкослойная хроматография может показать , как смесь соединений будет вести себя , когда очищают с помощью колоночной хроматографии. Разделение сначала оптимизируется с помощью тонкослойной хроматографии перед проведением колоночной хроматографии.
Подготовка колонки [ править ]
Колонку готовят, набивая твердый абсорбент в цилиндрическую стеклянную или пластиковую трубку. Размер будет зависеть от количества выделяемого соединения. В основании пробирки находится фильтр, либо пробка из ваты, либо стекловата, либо стеклянная фритта для удержания твердой фазы на месте. Резервуар для растворителя может быть прикреплен в верхней части колонки.
Обычно для подготовки колонки используются два метода: сухой и влажный. Для сухого метода колонка сначала заполняется сухим порошком неподвижной фазы, а затем добавляется подвижная фаза, которая пропускается через колонку до тех пор, пока она полностью не станет влажной, и с этого момента никогда не будет работать всухую. [1] Для мокрого метода готовят суспензию элюента с порошком неподвижной фазы, а затем осторожно выливают в колонку. Верх диоксида кремния должен быть плоским, а верх диоксида кремния можно защитить слоем песка. Элюент медленно проходит через колонку для продвижения органического материала.
Отдельные компоненты удерживаются неподвижной фазой по-разному и отдельно друг от друга, пока они проходят с разной скоростью через колонку с элюентом. В конце колонки они элюируются по одному. В течение всего процесса хроматографии элюент собирают серией фракций . Фракции могут собираться автоматически с помощью сборщиков фракций. Производительность хроматографии может быть увеличена за счет одновременного использования нескольких колонок. В этом случае используются многопоточные коллекторы. Состав потока элюента можно контролировать, и каждая фракция анализируется на содержание растворенных соединений, например, с помощью аналитической хроматографии, УФ-спектров поглощения или флуоресценции.. Цветные соединения (или флуоресцентные соединения с помощью УФ-лампы) можно увидеть сквозь стеклянную стену в виде движущихся полос.
Стационарная фаза [ править ]
Стационарная фаза или адсорбент в хроматографии на колонке является твердой. Наиболее распространенной стационарной фазой для колоночной хроматографии является силикагель , за ним следует оксид алюминия . В прошлом часто использовался порошок целлюлозы . Доступен широкий спектр стационарных фаз для проведения ионообменной хроматографии , обращенно-фазовой хроматографии (RP), аффинной хроматографии или адсорбции в расширенном слое (EBA). В стационарных фазахобычно представляют собой тонко измельченные порошки или гели и / или микропористые для увеличенной поверхности, хотя в EBA используется псевдоожиженный слой. Существует важное соотношение между массой неподвижной фазы и сухой массой смеси аналитов, которую можно наносить на колонку. Для колоночной хроматографии на диоксиде кремния это соотношение находится в пределах от 20: 1 до 100: 1, в зависимости от того, насколько близко друг к другу элюируются компоненты анализируемого вещества. [2]
Подвижная фаза (элюент) [ править ]
Подвижная фаза или элюент представляет собой растворитель или смесь растворителей , используемых для перемещения соединений через колонку. Его выбирают так, чтобы значение фактора удерживания интересующего соединения составляло примерно 0,2-0,3, чтобы минимизировать время и количество элюента для проведения хроматографии. Элюент также был выбран таким образом, чтобы можно было эффективно разделять различные соединения. Элюент оптимизируют в небольших предварительных испытаниях, часто с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) с той же неподвижной фазой.
Для каждой отдельной сепарации существует оптимальная скорость потока . Более высокая скорость потока элюента сводит к минимуму время, необходимое для работы колонки, и тем самым минимизирует диффузию, что приводит к лучшему разделению. Однако максимальная скорость потока ограничена, поскольку аналиту требуется конечное время для установления равновесия между стационарной и подвижной фазами, см. Уравнение Ван Деемтера . Простая лабораторная колонка работает самотеком . Скорость потока такой колонки может быть увеличена за счет расширения колонки, заполненной свежим элюентом, над верхом неподвижной фазы или уменьшена с помощью регулятора давления. Более высокая скорость потока может быть достигнута с помощью насоса или сжатого газа (например, воздуха, азота или аргона.), чтобы пропустить растворитель через колонку (колоночная флэш-хроматография). [3] [4]
Размер частиц неподвижной фазы обычно меньше при флэш-хроматографии на колонке, чем при колоночной гравитационной хроматографии. Например, одна из наиболее широко используемых марок силикагеля в первом методе - это силикагель с ячейками 230–400 (40–63 мкм), тогда как во втором методе обычно требуется силикагель с размером ячеек 70–230 (63–200 мкм). [5]
Была разработана электронная таблица, которая помогает в успешной разработке столбцов Flash. В электронной таблице оцениваются удерживаемый объем и объем полосы аналитов, числа фракций, которые, как ожидается, будут содержать каждый аналит, и разрешение между соседними пиками. Эта информация позволяет пользователям выбирать оптимальные параметры для разделений в препаративном масштабе до того, как будет предпринята попытка использования флэш-колонки. [6]
Автоматизированные системы [ править ]
Колоночная хроматография - чрезвычайно трудоемкий этап в любой лаборатории и может быстро стать узким местом для любой производственной лаборатории. Многие производители, такие как Biotage, Buchi, Interchim и Teledyne Isco, разработали системы автоматической флэш-хроматографии (обычно называемые LPLC, жидкостной хроматографией низкого давления, около 350–525 кПа или 50,8–76,1 фунт / кв. Дюйм), которые минимизируют участие человека в процессе очистки. Автоматизированные системы будут включать компоненты, обычно используемые в более дорогой высокоэффективной жидкостной хроматографии.(ВЭЖХ) системы, такие как градиентный насос, отверстия для ввода пробы, УФ-детектор и коллектор фракций для сбора элюента. Обычно эти автоматизированные системы могут разделять образцы от нескольких миллиграммов до многих килограммов в промышленных масштабах и предлагают гораздо более дешевое и быстрое решение для выполнения множественных инъекций в системах препаративной ВЭЖХ.
Разрешение (или способность разделять смесь) в системе LPLC всегда будет ниже по сравнению с HPLC, поскольку насадочный материал в колонке HPLC может быть намного меньше, обычно всего 5 микрометров, таким образом увеличивая площадь поверхности неподвижной фазы, увеличивая поверхностные взаимодействия. и дает лучшее разделение. Однако использование этой небольшой насадочной среды вызывает высокое противодавление, поэтому ее называют жидкостной хроматографией высокого давления. Колонны LPLC обычно заполнены диоксидом кремния толщиной около 50 микрометров, что снижает противодавление и разрешение, но также устраняет необходимость в дорогостоящих насосах высокого давления. В настоящее время производители начинают переходить на системы флэш-хроматографии высокого давления и называют их системами жидкостной хроматографии среднего давления (MPLC), которые работают при давлении выше 1 МПа (150 фунтов на кв. Дюйм).
Расчет разрешения колоночной хроматограммы [ править ]
Обычно для колоночной хроматографии используются перистальтические насосы, проточные буферы и образец раствора через верх колонки. Растворы и буферы проходят через колонку, где коллектор фракций в конце колонки собирает элюированные образцы. Перед сбором фракций образцы, которые элюируются из колонки, проходят через детектор, такой как спектрофотометр или масс-спектрометр, чтобы можно было определить концентрацию разделенных образцов в смеси растворов образцов.
Например, если вы должны отделить два разных белка с разной способностью связывания с колонкой от образца раствора, хорошим типом детектора будет спектрофотометр, использующий длину волны 280 нм. Чем выше концентрация белка, который проходит через элюированный раствор через колонку, тем выше поглощение этой длины волны.
Поскольку колоночная хроматография имеет постоянный поток элюированного раствора, проходящего через детектор при различных концентрациях, детектор должен отображать концентрацию элюированного образца с течением времени. Этот график зависимости концентрации образца от времени называется хроматограммой.
Конечная цель хроматографии - отделить различные компоненты от смеси растворов. Разрешение выражает степень разделения компонентов смеси. Чем выше разрешение хроматограммы, тем лучше разделение проб на колонке. Эти данные - хороший способ определить разделительные свойства колонки этого конкретного образца. Разрешение можно рассчитать по хроматограмме.
Отдельные кривые на диаграмме представляют различные профили концентрации элюируемой пробы во времени в зависимости от их сродства к смоле колонки. Для расчета разрешения требуются время удерживания и ширина кривой.
Время удерживания - это время от начала обнаружения сигнала детектором до высоты пика профиля концентрации элюирования каждого отдельного образца.
Ширина кривой - это ширина кривой профиля концентрации различных образцов на хроматограмме в единицах времени.
Упрощенный метод расчета разрешения хроматограммы заключается в использовании модели пластины. [7] Модель тарелки предполагает, что колонна может быть разделена на определенное количество секций или тарелок, и баланс массы может быть рассчитан для каждой отдельной тарелки. Этот подход приближает типичную кривую хроматограммы к кривой распределения Гаусса . Таким образом, ширина кривой оценивается как 4-кратное стандартное отклонение кривой, 4σ. Время удерживания - это время от начала обнаружения сигнала до времени пика гауссовой кривой.
Из переменных, представленных на рисунке выше, можно рассчитать разрешение, номер тарелки и высоту тарелки модели колонны-тарелки с помощью формул:
Разрешение (R s )
R s = 2 (t RB - t RA ) / (w B + w A )
Где:
t RB = время удерживания растворенного вещества B
t RA = время удерживания растворенного вещества A
w B = ширина гауссовой кривой растворенного вещества B
w A = ширина гауссовой кривой растворенного вещества A
Число пластин (N):
N = (t R ) 2 / (w / 4) 2
Высота тарелки (H):
H = L / N,
где L - длина колонны. [7]
Равновесие адсорбции в колонке [ править ]
Для адсорбционной колонки смола колонки (неподвижная фаза) состоит из микрошариков. Даже более мелкие частицы, такие как белки, углеводы, ионы металлов или другие химические соединения, конъюгированы с микрогранулами. Можно предположить, что каждая связывающая частица, прикрепленная к микрогранулам, связывается в соотношении 1: 1 с пробой растворенного вещества, отправляемой через колонку, которую необходимо очистить или разделить.
Связывание между разделяемой целевой молекулой и связывающей молекулой на шариках колонки можно смоделировать с помощью простой равновесной реакции K eq = [CS] / ([C] [S]), где K eq - константа равновесия , [C] и [S] - концентрации целевой молекулы и связывающей молекулы на смоле колонки, соответственно. [CS] - это концентрация комплекса целевой молекулы, связанной со смолой колонки. [7]
Используя это в качестве основы, можно использовать три разные изотермы для описания динамики связывания при колоночной хроматографии: линейная, Ленгмюровская и Фрейндлих.
Линейная изотерма возникает, когда концентрация растворенного вещества, необходимая для очистки, очень мала по отношению к связывающей молекуле. Таким образом, равновесие можно определить как:
[CS] = K экв [C].
Для использования в промышленных масштабах необходимо учитывать общее количество связывающих молекул на шариках смолы колонки, поскольку необходимо учитывать незанятые участки. Изотермы Ленгмюра и Фрейндлиха Изотерма полезны при описании этого равновесия. Изотерма Ленгмюра:
[CS] = (K экв S tot [C]) / (1 + K экв [C]), где S tot - общее количество связывающих молекул на гранулах.
Изотерма Фрейндлиха:
[CS] = K экв [C] 1 / n
Изотерма Фрейндлиха используется, когда колонка может связываться со многими различными образцами в растворе, который необходимо очистить. Поскольку множество разных образцов имеют разные константы связывания с шариками, существует много разных Keq. Следовательно, изотерма Ленгмюра не является хорошей моделью для связывания в этом случае. [7]
См. Также [ править ]
- Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) для колоночной хроматографии под высоким давлением.
- Быстрая жидкостная хроматография белков (FPLC) для разделения белков с помощью колоночной хроматографии.
Ссылки [ править ]
- ^ Шустерман, AJ; McDougal, PG; Гласфельд, А (1997). «Сухая колоночная флэш-хроматография». J Chem Educ . 74 (10): 1222. Bibcode : 1997JChEd..74.1222S . DOI : 10.1021 / ed074p1222 . ISSN 0021-9584 .
- ^ «Как настроить колонку с силикагелем для флэш-хроматографии и действительно преуспеть в разделении» . достигнутьdevices.com . REACH Devices, LLC . Дата обращения 3 января 2019 .
- ^ Тем не менее, WC; Кан, М; Митра, А (1978). «Быстрая хроматография для препаративного разделения с умеренным разрешением». J Org Chem . ACS . 43 (14): 2923–2925. DOI : 10.1021 / jo00408a041 .
- ↑ Harwood LM, Moody CJ (13 июня 1989 г.). Экспериментальная органическая химия: принципы и практика (иллюстрированный ред.). Лондон: Блэквелл. С. 180–185 . ISBN 978-0-632-02017-1. OCLC 1079261960 .
- ^ «Силикагель для сбора материала для колоночной хроматографии с нормальной фазой» . Материальный урожай. 2008 . Дата обращения 3 января 2019 .
- ^ Ярмарка, JD; Кормос, CM (2008). «Флэш-хроматограммы на колонке, оцененные по данным тонкослойной хроматографии». J Chromatogr . 1211 (1–2): 49–54. DOI : 10.1016 / j.chroma.2008.09.085 . ISSN 0021-9673 . PMID 18849041 .
- ^ а б в г Харрисон Р.Г., Тодд П.В., Радж С.Р., Петридес Д.П. (2003). Наука и техника биоразделений (2-е изд.). Нью-Йорк, Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета . ISBN 9780190213732. OCLC 899240244 .
Внешние ссылки [ править ]
- Руководство по флэш-хроматографии на колонке (pdf)
- Радиально-поточная хроматография
| vтеХроматография | |
|---|---|
| Методы |
|
| Перенесенные через дефис методы |
|
| Теория |
|
| Выдающиеся публикации |
|
| |
Категория
Commons
