Рекомбинация Cre-Lox
Рекомбинация Cre-Lox представляет собой сайт-специфическую рекомбиназную технологию , используемую для выполнения делеций , вставок , транслокаций и инверсий.в определенных участках ДНК клеток. Это позволяет нацеливать модификацию ДНК на определенный тип клеток или запускать ее с помощью определенного внешнего стимула. Он реализуется как в эукариотических, так и в прокариотических системах. Система рекомбинации Cre-lox оказалась особенно полезной, чтобы помочь неврологам изучить мозг, в котором сложные типы клеток и нейронные цепи объединяются, чтобы генерировать познание и поведение. NIH Blueprint for Neuroscience Research создал несколько сотен линий мышей с драйверами Cre, которые в настоящее время используются мировым нейробиологическим сообществом.
Система состоит из одного фермента, рекомбиназы Cre , которая рекомбинирует пару коротких последовательностей-мишеней, называемых последовательностями Lox . Эта система может быть реализована без вставки каких-либо дополнительных вспомогательных белков или последовательностей. Фермент Cre и исходный сайт Lox , называемый последовательностью LoxP , получены из бактериофага P1 .
Правильное размещение последовательностей Lox позволяет генам активироваться, подавляться или заменяться другими генами. На уровне ДНК можно проводить многие виды манипуляций. Активность фермента Cre можно контролировать так, чтобы он экспрессировался в клетках определенного типа или запускался внешним раздражителем, таким как химический сигнал или тепловой шок. Эти целевые изменения ДНК полезны для отслеживания клеточных линий и когда мутанты смертельны при глобальном выражении.
Рекомбинация Cre-Lox представляет собой особый тип сайт-специфической рекомбинации , разработанный доктором Брайаном Зауэром и запатентованный DuPont , который работает как в митотических, так и в немитотических клетках и первоначально использовался для активации экспрессии генов в клеточных линиях млекопитающих. [2] [3] [4] Впоследствии исследователи в лаборатории доктора Джейми Мартапродемонстрировали, что рекомбинация Cre-Lox может быть использована для удаления последовательностей хромосомной ДНК, фланкированных loxP, с высокой эффективностью в специфических развивающихся Т-клетках трансгенных животных, при этом авторы предполагают, что этот подход можно использовать для определения эндогенной функции гена в определенных типах клеток, неизгладимо маркируют предшественников в исследованиях определения судеб клеток, индуцируют специфические хромосомные перестройки для биологического моделирования и моделирования болезней и определяют роль ранних генетических повреждений в поддержании болезни (и фенотипа). [5]
Вскоре после этого исследователи из лаборатории профессора Клауса Раевски сообщили о производстве плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, несущих целевой ген ДНК-полимеразы, фланкированный loxP (floxed). [6] Сочетая эти достижения в сотрудничестве, лаборатории докторов. Март и Раевски сообщили в 1994 году, что рекомбинация Cre-lox может быть использована для условного нацеливания генов. [7] Они обнаружили, что ≈50% гена ДНК-полимеразы бета было удалено в Т-клетках на основе блоттинга ДНК. Было неясно, имел ли только один аллель в каждой Т-клетке или 50% Т-клеток 100% делецию в обоих аллелях. С тех пор исследователи сообщили о более эффективном мутагенезе условного гена Cre- Lox в развивающихся Т-клетках лабораторией Марта в 1995 году.Cre-рекомбиназа нередко встречается в клетках, когда существуют две копии последовательностей floxed, и позволяет формировать и изучать химерные ткани. Было показано, что все типы клеток, протестированные на мышах, подвергаются трансгенной рекомбинации Cre.
Независимо от этого, Джо З. Цзянь стал пионером в использовании системы Cre-loxP для манипуляций с генами, специфичными для типов и областей клеток, во взрослом мозге, где могут существовать сотни различных типов нейронов, и известно, что почти все нейроны во взрослом мозге являются вторичными. -митотический. [9] Tsien и его коллеги продемонстрировали, что Cre-опосредованная рекомбинация может происходить в постмитотических пирамидных нейронах переднего мозга взрослых мышей. [10]
