Криофиксация - это метод фиксации или стабилизации биологических материалов на первом этапе подготовки образцов для электронной микроскопии и криоэлектронной микроскопии . [1] Типичные образцы для криофиксации включают небольшие образцы тканей растений или животных , клеточные суспензии микроорганизмов или культивируемых клеток , суспензии вирусов или вирусных капсидов и образцы очищенных макромолекул , особенно белков . [2] [3]
Типы крио фиксации
1. замораживание-сушка
2. Замораживание-подмена
3. замораживание-травление
Погружное замораживание
Метод включает сверхбыстрое охлаждение небольших образцов тканей или клеток до температуры жидкого азота (-196 ° C) или ниже, прекращение всех движений и метаболической активности и сохранение внутренней структуры путем замораживания всех жидких фаз в твердом состоянии. Обычно образец погружается в жидкий азот или в жидкий этан или жидкий пропан в контейнере, охлаждаемом жидким азотом. Конечная цель состоит в том, чтобы заморозить образец настолько быстро (со скоростью от 10 4 до 10 6 К в секунду), чтобы кристаллы льда не могли образовываться или не могли вырасти достаточно большими, чтобы вызвать повреждение ультраструктуры образца . Формирование образцов, содержащих образцы в аморфном льду, является « святым Граалем » биологической криомикроскопии. [ необходима цитата ]
На практике очень трудно достичь достаточно высоких скоростей охлаждения для образования аморфного льда в образцах толщиной более нескольких микрометров . С этой целью погружение образца в жидкий азот с его температурой кипения (-196 ° C) [4] не всегда приводит к достаточно быстрому замораживанию образца по нескольким причинам. Во-первых, жидкий азот быстро закипает вокруг образца, образуя пленку изолирующего азота.
2газ, который замедляет передачу тепла криогенной жидкости, известный как эффект Лейденфроста . Скорость охлаждения можно улучшить, прокачивая жидкий азот пластинчато-роторным вакуумным насосом в течение нескольких десятков секунд перед тем, как погрузить в него образец. Это понижает температуру жидкого азота ниже точки кипения, так что когда образец погружается в него, он плотно обволакивает образец на короткий период времени и более эффективно отводит от него тепло. Еще более быстрое охлаждение может быть достигнуто путем погружения образцов в жидкий пропан или этан (этан оказался более эффективным) [5], охлажденный очень близко к их точкам плавления с использованием жидкого азота [6], или путем ударов образца по хорошо отполированному жидкому азоту. - охлаждаемые металлические поверхности из меди или серебра . [7] Во-вторых, два свойства самой воды препятствуют быстрому криофиксации больших образцов. [8] теплопроводность льда очень мала по сравнению с тем из металлов , и выпускает воду из скрытой теплоты плавления , как она замерзает, разбив быстрое время восстановления в образцах более толстых несколько микрометров.
Заморозка под высоким давлением
Высокое давление помогает предотвратить образование крупных кристаллов льда. Самостоятельное быстрое замораживание (SPRF) может использовать множество различных криогенов, что недавно было рекламировано как привлекательная и недорогая альтернатива замораживанию под высоким давлением (HPF). [9]
Рекомендации
- ^ Pilhofer, Мартин; Ладинский, Марк С .; McDowall, Alasdair W .; Дженсен, Грант Дж. (2010). «Бактериальный ТЭМ». Методы клеточной биологии . Методы клеточной биологии. 96 : 21–45. DOI : 10.1016 / S0091-679X (10) 96002-0 . ISBN 9780123810076. ISSN 0091-679X . PMID 20869517 .
- ^ Эчлин П. (1992). Низкотемпературная микроскопия и анализ . Нью-Йорк: Plenum Publishing Corporation.
- ^ Dubochet J, Адриан M, Чанг JJ, Homo JC, Lepault J, McDowall AW, Schulz P (1988). «Криоэлектронная микроскопия застеклованных образцов» (PDF) . Ежеквартальный обзор биофизики . 21 (2): 129–228. DOI : 10.1017 / s0033583500004297 . PMID 3043536 .
- ^ Баттерсби Б. Дж., Шарп Дж. С., Уэбб Р. И., Барнс Г. Т. (1994). «Стеклование водных суспензий из контролируемой среды для электронной микроскопии: улучшенное устройство погружного охлаждения». Журнал микроскопии . 176 (2): 110–120. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.1994.tb03505.x .
- ^ Райан, Кейт П. (1992). «Криофиксация тканей для электронной микроскопии: обзор методов погружного охлаждения» (PDF) . Сканировать. Microsc . 6 (3): 715–743.
- ^ Лысый WB (1984). «Относительная эффективность криогенных жидкостей, используемых для быстрого охлаждения криогенных образцов». Журнал микроскопии . 134 (3): 261–270. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.1984.tb02519.x .
- ^ Эллисон Д.П., Доу С.С., Рорвик М.С. (1987). «Построение и работа простого и недорогого устройства шоковой заморозки для электронной микроскопии». Журнал микроскопии . 147 (Pt 1): 103–108. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.1987.tb02822.x . PMID 3305955 .
- ^ Лысый WB (1987). Количественная криофиксация . Бристоль и Филадельфия: Адам Хильгер.
- ^ Леуниссен Ян Л.М. и Йи Х. (2009). «Быстрая заморозка под давлением (SPRF): новый метод криофиксации для подготовки образцов в электронной микроскопии» . J. Microsc . 235 (1): 25–35. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.2009.03178.x . PMID 19566624 . Архивировано из оригинала на 2013-01-05.