Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Система доставки частиц PDS-1000 / He

В генной инженерии , A генная пушка или биолистическая система доставки частиц является устройство , используемым для доставки экзогенных ДНК ( трансгенов ), РНК или белок в клетки. Покрывая частицы тяжелого металла интересующим геном и стреляя этими микрочастицами в клетки с использованием механической силы, можно вызвать интеграцию желаемой генетической информации в клетки. Техника, связанная с такой доставкой ДНК микрочастицами, часто называется биолистикой . [1]

Это устройство способно трансформировать практически любой тип клетки и не ограничивается трансформацией ядра; он также может трансформировать органеллы, включая пластиды и митохондрии . [2]

Генная пушка используется для доставки экзогенной ДНК в клетки. Этот метод известен как «биолистика». Генные пушки можно эффективно использовать на большинстве клеток, но в основном они используются на клетках растений. Шаг 1 Аппарат генной пушки готов к стрельбе. Шаг 2 Гелий заполняет камеру, и давление на разрывную мембрану увеличивается. Шаг 3 Давление в конечном итоге достигает точки, в которой разрывной диск разрывается, и возникающий в результате выброс гелия толкает макроноситель, покрытый ДНК / золотом («Пластиковый диск»), в стопорный экран. Шаг 4 Когда макроноситель попадает в стопорный экран, покрытые ДНК частицы золота продвигаются через экран в клетки-мишени.

Дизайн генного пистолета [ править ]

Первоначально генная пушка была пневматическим пистолетом Кросмана, модифицированным для стрельбы плотными частицами вольфрама . Он был изобретен Джоном С. Сэнфордом , Эд Вольфом и Нельсоном Алленом из Корнельского университета [3] [4] [5] вместе с Тедом Кляйном из DuPont в период с 1983 по 1986 год. Первоначальной целью был лук (выбранный из-за его большого размера ячейки) , и устройство использовалось для доставки частиц, покрытых маркером генов, которые будут передавать сигнал, если произойдет правильная вставка транскрипта ДНК. [6] Генетическая трансформация была продемонстрирована после наблюдаемой экспрессии маркерного гена в луковых клетках.

Самые ранние генные пушки, изготовленные на заказ (изготовленные Нельсоном Алленом), использовали патрон для гвоздя 22 калибра, чтобы продвигать полиэтиленовый цилиндр (пулю) по стволу Дугласа 22 калибра. Капля вольфрамового порошка, покрытая генетическим материалом, помещалась на пулю и сбивалась в чашку Петри внизу. Пуля приварилась к диску под чашкой Петри, и генетический материал попал в образец с эффектом пончика, включающим разрушение в середине образца с кольцом хорошей трансформации по периферии. Пушка была подключена к вакуумному насосу и во время стрельбы находилась под вакуумом. Ранний дизайн был запущен в ограниченное производство на Rumsey-Loomis (местная механическая мастерская тогда на Мекленбург-роуд в Итаке, Нью-Йорк, США).

Biolistics, Inc продала Dupont права на производство и распространение обновленного устройства с усовершенствованиями, включая использование гелия в качестве невзрывоопасного топлива и механизм доставки столкновения нескольких дисков, чтобы минимизировать повреждение тканей образца. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро , также используются для доставки генетического материала, причем предпочтение отдается золоту из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями снарядов. [7]

Дизайн биолистической конструкции [ править ]

Биолистическая трансформация включает интеграцию функционального фрагмента ДНК, известного как конструкция ДНК, в клетки-мишени. Генная конструкция представляет собой кассету ДНК, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в организме-мишени. [8] [ необходима страница ] Хотя конструкция гена может различаться в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию промоторной последовательности, терминаторной последовательности, представляющего интерес гена и репортерного гена .

Промоутер:

Промоторы контролируют расположение и величину экспрессии гена и действуют как «рулевое колесо и педаль газа» для гена. [8] [ необходима страница ] Промоторы предшествуют интересующему гену в конструкции ДНК и могут быть изменены в лабораторных условиях для точной настройки экспрессии трансгена. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты является примером обычно используемого промотора, который приводит к устойчивой конститутивной экспрессии генов в растениях. [9]

Терминатор:

Последовательности терминатора необходимы для правильной экспрессии гена и размещаются после кодирующей области интересующего гена в конструкции ДНК. Обычным терминатором биолистической трансформации является терминатор NOS, полученный из Agrobacterium tumefaciens . Из-за высокой частоты использования этого терминатора в генно-инженерных растениях были разработаны стратегии для обнаружения его присутствия в пищевых продуктах для отслеживания несанкционированных генетически модифицированных культур. [10]

Репортерный ген:

Ген, кодирующий селективный маркер, является общим элементом в конструкциях ДНК и используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбранный селектируемый маркер будет зависеть от трансформируемого вида, но обычно это будет ген, наделяющий клетки детоксикационной способностью к определенным гербицидам или антибиотикам, таким как канамицин , гигромицин B или глифосат [8] [ необходима страница ] . [11] [12] [13]

Дополнительные элементы:

Необязательные компоненты конструкции ДНК включают такие элементы, как последовательности cre-lox , которые позволяют контролируемое удаление конструкции из целевого генома. [14] Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным представляющим интерес геном.

Заявление [ править ]

Генные пушки в основном используются с растительными клетками. Тем не менее, его можно использовать и для людей, и для других животных.

Растения [ править ]

Мишенью генной пушки часто является каллус недифференцированных растительных клеток или группа незрелых зародышей, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После того, как покрытые ДНК золотые частицы доставлены в клетки, ДНК используется в качестве матрицы для транскрипции (временная экспрессия), а иногда она интегрируется в хромосому растения («стабильная» трансформация).

Если доставленная конструкция ДНК содержит селектируемый маркер, то можно отобрать и культивировать стабильно трансформированные клетки с использованием методов культивирования тканей. Например, если доставленная конструкция ДНК содержит ген, который придает устойчивость к антибиотику или гербициду, то можно выбрать стабильно трансформированные клетки путем включения этого антибиотика или гербицида в среду для тканевой культуры.

Трансформированные клетки можно обрабатывать рядом гормонов растений, таких как ауксины и гиббереллины , и каждый может делиться и дифференцироваться в организованные специализированные тканевые клетки всего растения. Эта способность полной регенерации называется тотипотентностью . Новое растение, возникшее из успешно трансформированной клетки, может иметь новые наследуемые признаки. Использование генной пушки можно противопоставить использованию Agrobacterium tumefaciens и ее плазмиды Ti для вставки ДНК в клетки растений. Смотрите трансформацию для различных методов трансформации у разных видов.

Люди и другие животные [ править ]

Генные пушки также использовались для доставки ДНК-вакцин .

Доставка плазмид в нейроны крысы с помощью генной пушки, в частности нейронов DRG, также используется в качестве фармакологического предшественника при изучении эффектов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера .

Генная пушка стала обычным инструментом для маркировки подмножеств клеток в культивируемых тканях. Помимо способности трансфицировать клетки ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генная пушка может быть адаптирована для доставки в клетки широкого спектра жизненно важных красителей. [15]

Бомбардировка генной пушкой также использовалась для трансформации Caenorhabditis elegans в качестве альтернативы микроинъекции . [16]

Преимущества [ править ]

Биолистика оказалась универсальным методом генетической модификации, и, как правило, предпочтительнее создавать устойчивые к трансформации культуры, такие как зерновые . Примечательно, что кукуруза Bt - продукт биолистики. [8] [ необходима страница ] Трансформация пластид также показала большой успех при бомбардировке частицами по сравнению с другими современными методами, такими как трансформация, опосредованная Agrobacterium , у которых есть трудности с направлением вектора и стабильной экспрессией в хлоропласте. [8] [ необходима страница ] [17] Кроме того, нет сообщений о подавлении хлоропластов.трансген вставлен с помощью генной пушки. [18] Кроме того, всего за один выстрел из генной пушки квалифицированный техник может создать два трансформированных организма. [17] Эта технология даже позволила модифицировать определенные ткани in situ , хотя это может повредить большое количество клеток и трансформировать только некоторые , а не все клетки ткани. [19]

Ограничения [ править ]

Биолистика случайным образом вводит ДНК в клетки-мишени. Таким образом, ДНК может быть трансформирована в любые геномы, присутствующие в клетке, будь то ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя правильный дизайн конструкции может смягчить это. Доставка и интеграция нескольких матриц конструкции ДНК - отличная возможность, приводящая к потенциально переменным уровням экспрессии и количеству копий встроенного гена. [8] [ необходима страница ] Это связано со способностью конструкций отдавать и брать генетический материал от других конструкций, в результате чего одни не несут трансген, а другие - несколько копий; количество вставленных копий зависит как от того, сколько копий трансгена имеет вставленная конструкция, так и от того, сколько было вставлено.[8] [ необходима страница ] Кроме того, поскольку эукариотические конструкции полагаются на незаконную рекомбинацию - процесс, посредством которого трансген интегрируется в геном без аналогичных генетических последовательностей, - а не на гомологичную рекомбинацию , они не могут быть нацелены на определенные места в геноме, [ 8] [ необходима страница ], если трансген не доставляется совместно среагентами для редактирования генома .

Ссылки [ править ]

  1. ^ О'Брайен, Джон А .; Ламмис, Сара CR (2011). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера» . BMC Biotechnology . 11 : 66. DOI : 10,1186 / 1472-6750-11-66 . PMC  3144454 . PMID  21663596 .
  2. ^ Сэнфорд, Джон С. (1990). «Биолистическая трансформация растений». Physiologia Plantarum . 79 (1): 206–209. DOI : 10.1111 / j.1399-3054.1990.tb05888.x . ISSN 1399-3054 . 
  3. ^ Segelken, Роджер (14 мая 1987). «Биолог изобрел пистолет для стрельбы по клеткам ДНК» (PDF) . Корнельские хроники . п. 3. Архивировано из оригинального (PDF) 29 октября 2013 года . Дата обращения 5 июня 2014 .
  4. ^ Сэнфорд, JC; Klein, TM; Wolf, ED; Аллен, Н. (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с использованием процесса бомбардировки частицами». Наука и технология частиц . 5 (1): 27–37. DOI : 10.1080 / 02726358708904533 .
  5. ^ Кляйн, TM; Wolf, ED; Wu, R .; Сэнфорд, JC (май 1987 г.). «Высокоскоростные микрочастицы для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки». Природа . 327 (6117): 70–73. Bibcode : 1987Natur.327 ... 70K . DOI : 10.1038 / 327070a0 . S2CID 4265777 . 
  6. ^ Сегелкен, Роджер. «Генный дробовик» . Колледж сельского хозяйства и наук о жизни Корнельского университета. Архивировано из оригинального 26 апреля 2010 года . Дата обращения 5 июня 2014 .
  7. ^ Рассел, Джули А .; Рой, Михир К .; Сэнфорд, Джон К. (1992-03-01). «Физическая травма и отравление вольфрамом снижают эффективность биологической трансформации» . Физиология растений . 98 (3): 1050–1056. DOI : 10.1104 / pp.98.3.1050 . ISSN 0032-0889 . PMC 1080307 . PMID 16668726 .   
  8. ^ a b c d e f g h Слейтер, Адриан; Скотт, Найджел; Фаулер, Марк (2008). Биотехнология растений: генетические манипуляции с растениями (2-е изд.). Оксфорд, Нью-Йорк, США: ISBN Oxford University Press Inc. 978-0-19-928261-6.
  9. ^ Бенфей, ПН; Чуа, Н.-Х. (1990-11-16). «Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты: комбинаторная регуляция транскрипции в растениях». Наука . 250 (4983): 959–966. Bibcode : 1990Sci ... 250..959B . DOI : 10.1126 / science.250.4983.959 . ISSN 0036-8075 . PMID 17746920 . S2CID 35471862 .   
  10. ^ «терминатор нопалин-синтазы: темы по Science.gov» . www.science.gov . Проверено 20 ноября 2019 .
  11. ^ Норрис, MH; Kang, Y .; Лу, Д .; Wilcox, BA; Хоанг, TT (31 июля 2009 г.). «Устойчивость к глифосату как новый селективный агент-совместимый, не выбираемый антибиотиками маркер в хромосомном мутагенезе основных генов asd и dapB Burkholderia pseudomallei» . Прикладная и экологическая микробиология . 75 (19): 6062–6075. DOI : 10,1128 / aem.00820-09 . ISSN 0099-2240 . PMC 2753064 . PMID 19648360 .   
  12. ^ Блохлингер, K; Диггельманн, Х (декабрь 1984 г.). «Фосфотрансфераза гигромицина B в качестве селектируемого маркера для экспериментов по переносу ДНК с высшими эукариотическими клетками» . Молекулярная и клеточная биология . 4 (12): 2929–2931. DOI : 10.1128 / mcb.4.12.2929 . ISSN 0270-7306 . PMC 369308 . PMID 6098829 .   
  13. ^ Каррер, Хелайн; Хокенберри, Тиш Ноэль; Сваб, Зора; Малига, Пал (октябрь 1993 г.). «Устойчивость к канамицину как селектируемый маркер трансформации пластид табака». MGG Molecular & General Genetics . 241–241 (1–2): 49–56. DOI : 10.1007 / bf00280200 . ISSN 0026-8925 . PMID 8232211 . S2CID 2291268 .   
  14. ^ Gilbertson Ларри (декабрь 2003). «Cre – lox-рекомбинация: творческие инструменты для биотехнологии растений». Тенденции в биотехнологии . 21 (12): 550–555. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2003.09.011 . ISSN 0167-7799 . PMID 14624864 .  
  15. ^ Гань, Вэнь-Бяо; Груцендлер, Хайме; Вонг, Вай Тонг; Вонг, Рэйчел О.Л .; Лихтман, Джефф В (2000). «Многоцветная» диолистическая «маркировка нервной системы с использованием комбинаций липофильных красителей». Нейрон . 27 (2): 219–25. DOI : 10.1016 / S0896-6273 (00) 00031-3 . PMID 10985343 . S2CID 16962732 .  
  16. ^ Praitis Вида (2006). «Создание трансгенных линий с использованием методов бомбардировки микрочастицами». C. Elegans . Методы молекулярной биологии. 351 . С. 93–108. DOI : 10.1385 / 1-59745-151-7: 93 . ISBN 978-1-59745-151-2. PMID  16988428 .
  17. ^ a b Сэнфорд, Джон (28 апреля 2006 г.). «Биолистическая трансформация растений». Physiologia Plantarum . 79 (1): 206–209. DOI : 10.1111 / j.1399-3054.1990.tb05888.x .
  18. ^ Киккерт, Джули; Видаль, Хосе; Райш, Брюс (2005). Стабильная трансформация растительных клеток с помощью бомбардировки частицами / биоистики . Методы молекулярной биологии. 286 . С. 61–78. DOI : 10.1385 / 1-59259-827-7: 061 . ISBN 978-1-59259-827-4. PMID  15310913 . S2CID  44395352 .
  19. ^ Hayward, MD; Bosemark, NO; Ромагоса, Т. (2012). Селекция растений: принципы и перспективы . Springer Science & Business Media. п. 131. ISBN. 9789401115247.

Дальнейшее чтение [ править ]

  • О'Брайен, Дж; Холт, М; Уайтсайд, G; Ламмис, Южная Каролина; Гастингс, MH (2001). «Модификации ручного генного пистолета: усовершенствования для биологической трансфекции in vitro органотипической нейрональной ткани». Журнал методов неврологии . 112 (1): 57–64. DOI : 10.1016 / S0165-0270 (01) 00457-5 . PMID  11640958 . S2CID  30561105 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Джон О'Брайен представляет ... стволы генного пистолета для получения дополнительной информации о биолистике.