Генотипирование путем секвенирования

В области генетической последовательности , генотипирование с помощью секвенирования , также называемый ГБСОМ , представляет собой способ , чтобы обнаружить единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNP), чтобы выполнить генотипирование исследования, такие как исследования ассоциации генома ( GWAS ). ^[1] GBS использует рестрикционные ферменты, чтобы уменьшить сложность генома и генотипировать несколько образцов ДНК. ^[2] После расщепления проводится ПЦР для увеличения пула фрагментов, а затем библиотеки GBS секвенируются с использованием технологий секвенирования следующего поколения, что обычно приводит к одностороннему считыванию около 100 пар оснований. ^[3]Это относительно недорогое средство, используемое в селекции растений . ^[2] Хотя GBS представляет подход, аналогичный методу секвенирования ДНК, ассоциированного с сайтами рестрикции (RAD-seq), они существенно отличаются друг от друга. ^[4]

Методы [ править ]

GBS - это надежная, простая и доступная процедура для обнаружения и сопоставления SNP. В целом, этот подход снижает сложность генома с помощью рестрикционных ферментов (RE) у разнообразных видов с большими геномами для эффективного высокопроизводительного и высоко мультиплексированного секвенирования. Используя соответствующие RE, можно избежать повторяющихся областей геномов и нацелить области с более низкой копией, что уменьшает проблемы выравнивания у генетически очень разнообразных видов. Метод был впервые описан Elshire et al. (2011). ^[1] Таким образом, высокомолекулярные ДНК извлекаются и перевариваются с использованием специфических RE, ранее определенных путем частого разрезания ^[5] основной повторяющейся фракции генома. ApeKIявляется наиболее часто используемым RE. Затем адаптеры штрих-кода лигируют к липким концам и проводят ПЦР-амплификацию . Выполняется технология секвенирования следующего поколения, в результате чего односторонние считывания составляют около 100 пар оснований. Необработанные данные последовательности фильтруются и выравниваются с эталонным геномом с использованием обычно инструмента выравнивания Берроуза-Уиллера (BWA) или Bowtie 2 . Следующим шагом является определение SNP из выровненных тегов и оценка всех обнаруженных SNP для различного охвата, глубины и генотипической статистики. После того, как будет запущено крупномасштабное производство SNP для всего вида, можно быстро вызвать известные SNP во вновь секвенированных образцах. ^[6]

При первоначальной разработке подход GBS был протестирован и валидирован на рекомбинантных инбредных линиях (RIL) из популяции картирования кукурузы с высоким разрешением (IBM) и линий ячменя с удвоенными гаплоидами (DH) из популяции картирования ячменя Вулф (OWB). До 96 образцов ДНК, расщепленных RE (ApeKI), объединяли и обрабатывали одновременно во время создания библиотеки GBS, которую проверяли на анализаторе генома II (Illumina, Inc.). В целом, 25 185 двуаллельных тегов были картированы в кукурузе, а 24 186 последовательностей были картированы в ячмене. Проверка маркеров GBS ячменя с использованием одной линии DH (OWB003) показала 99% совпадение между контрольными маркерами и нанесенными на карту показаниями GBS. Хотя у ячменя отсутствует полная последовательность генома, GBS не требует эталонного генома для картирования тегов последовательности, эталон разрабатывается в процессе выборочного генотипирования.Теги также можно рассматривать как доминантные маркеры для альтернативного генетического анализа в отсутствие эталонного генома. Помимо мультиплексного скимминга GBS, вменение отсутствующих SNP может еще больше снизить затраты на GBS. GBS - это универсальная и экономичная процедура, которая позволит извлекать данные из геномов любых видов без предварительного знания структуры их генома.^[1]

Ссылки [ править ]