Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Геномная ДНК сначала переваривается специфическим рестрикционным ферментом (ами) для фрагментации ДНК. Для анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ( ПДРФ ) эти фрагменты затем визуализируют с помощью гель- электрофореза . Для RADseq рестрикционные фрагменты лигируются с адаптером, который делает их доступными для чтения машинами секвенирования (не показаны), затем фрагменты выбранного диапазона размеров секвенируются с использованием методов секвенирования следующего поколения , выравниваются и сравниваются.

Маркеры ДНК, связанные с сайтом рестрикции (RAD), представляют собой тип генетического маркера, который полезен для ассоциативного картирования, QTL-картирования , популяционной генетики , экологической генетики и эволюции. Использование маркеров RAD для генетического картирования часто называют картированием RAD. Важным аспектом маркеров и картирования RAD является процесс выделения тегов RAD, которые представляют собой последовательности ДНК, которые непосредственно фланкируют каждый экземпляр конкретного сайта рестрикции рестрикционного фермента по всему геному. [1] После выделения меток RAD их можно использовать для идентификации и генотипирования полиморфизмов последовательностей ДНК, главным образом в форме однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) . [1] Полиморфизмы, которые идентифицируются и генотипируются путем выделения и анализа тегов RAD, называются маркерами RAD.

Изоляция тегов RAD [ править ]

Использование фланкирующих последовательностей ДНК вокруг каждого сайта рестрикции является важным аспектом тегов RAD. [1] Плотность RAD-меток в геноме зависит от рестрикционного фермента, используемого в процессе выделения. [2] Существуют и другие методы маркеров сайта рестрикции, такие как RFLP или полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP), которые используют полиморфизм длины фрагмента, вызванный различными сайтами рестрикции, для различения генетического полиморфизма. Использование фланкирующих ДНК-последовательностей в методах RAD-меток называется методом уменьшенного представления. [3]

Процедура начальная , чтобы изолировать тег RAD участвует переваривание ДНК с определенным ферментом рестрикции, лигирование биотинилированного адаптеры к свесам, случайным образом стрижки ДНК на фрагменты гораздо меньше , чем среднее расстояние между сайтами рестрикции, и выделением биотинилированных фрагментов с использованием стрептавидином шариков. [1] Эта процедура первоначально использовалась для выделения меток RAD для анализа микрочипов . [1] [4] [5] Совсем недавно процедура изоляции тегов RAD была изменена для использования с высокопроизводительным секвенированием на платформе Illumina , что дает преимущество в виде значительного снижения количества необработанных ошибок и высокой пропускной способности.[2] Новая процедура включает в себя переваривание ДНК с помощью определенного рестрикционного фермента (например: SbfI, NsiI,…), лигирование первого адаптера, называемого P1, к выступам, случайное разделение ДНК на фрагменты, намного меньшие, чем среднее расстояние между ними. сайты рестрикции, подготовка срезанных концов к тупым концам и лигирование второго адаптера (P2), а также использование ПЦР для специфической амплификации фрагментов, содержащих оба адаптера. Важно отметить, что первый адаптер содержит штрих-код короткой последовательности ДНК, называемый MID (молекулярный идентификатор), который используется в качестве маркера для идентификации различных образцов ДНК, которые объединены и секвенированы в одной реакции. [2] [6] Использование высокопроизводительного секвенирования для анализа тегов RAD можно классифицировать как секвенирование с сокращенным представлением, которое включает, среди прочего, RADSeq (RAD-Sequencing). [3]

Обнаружение и генотипирование маркеров RAD [ править ]

После выделения меток RAD их можно использовать для идентификации и генотипирования полиморфизмов последовательностей ДНК, таких как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). [1] [2] Эти полиморфные сайты называются маркерами RAD. Наиболее эффективный способ найти RAD - теги является высокой пропускной способностью ДНК секвенирования , [2] [6] называется RAD тег последовательности, РАД секвенирование, RADSeq или RADSeq.

До разработки технологий высокопроизводительного секвенирования маркеры RAD были идентифицированы путем гибридизации тегов RAD с микрочипами. [1] [4] [5] Из-за низкой чувствительности микрочипов этот подход может обнаруживать только полиморфизмы последовательностей ДНК, которые нарушают сайты рестрикции и приводят к отсутствию меток RAD, либо существенные полиморфизмы последовательностей ДНК, которые нарушают гибридизацию меток RAD. Следовательно, плотность генетических маркеров, которая может быть достигнута с помощью микрочипов, намного ниже, чем это возможно с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК. [7]

История [ править ]

Маркеры RAD были сначала реализованы с использованием микрочипов, а затем адаптированы для NGS (Next-Generation-Sequencing). [7] Он был разработан совместно лабораториями Эрика Джонсона и Уильяма Креско в Университете Орегона примерно в 2006 году. Они подтвердили полезность маркеров RAD, определив контрольные точки рекомбинации у D. melanogaster и обнаружив QTL у трехиглой колюшки. [1]

В 2012 году ученые опубликовали модифицированный метод маркировки RAD под названием двойной дайджест RADseq. [8] Они добавили второй рестрикционный фермент и жесткую процедуру выбора размера ДНК для выполнения недорогого генотипирования популяции.

Источники [ править ]

  1. ^ a b c d e f g h Миллер М. Р.; Dunham JP; Amores A; Креско WA; Джонсон EA (2007). «Быстрая и экономичная идентификация полиморфизма и генотипирование с использованием маркеров ДНК, ассоциированной с сайтом рестрикции (RAD)» . Геномные исследования . 17 (2): 240–248. DOI : 10.1101 / gr.5681207 . PMC  1781356 . PMID  17189378 .
  2. ^ a b c d e Бэрд Н.А.; Etter PD; Этвуд Т.С.; Currey MC; Дрожь AL; Льюис З.А.; Selker EU; Креско WA; Джонсон EA (2008). «Быстрое открытие SNP и генетическое картирование с использованием секвенированных маркеров RAD» . PLOS ONE . 3 (10): e3376. DOI : 10.1371 / journal.pone.0003376 .
  3. ^ а б Дэйви JW; Hohenlohe PA; Etter PD; Boone JQ; Catchen JM; Blaxter ML (2011). «Общегеномное открытие генетических маркеров и генотипирование с использованием секвенирования следующего поколения». Природа Обзоры Генетики . 12 : 499–510. DOI : 10.1038 / nrg3012 . PMID 21681211 . 
  4. ^ a b Миллер MR; Этвуд Т.С.; Eames BF; Эберхарт JK; Ян Ю.Л .; Postlethwait JH; Джонсон EA (2007). «Микроматрицы маркеров RAD позволяют быстро картировать мутации рыбок данио» . Genome Biol . 8 (6): R105. DOI : 10.1186 / GB-2007-8-6-R105 .
  5. ^ а б Льюис З.А.; Дрожь AL; Ребро жесткости N; Миллер MR; Джонсон Э.А.; Селкер ЕС (2007). «Выявление высокой плотности маркеров ДНК, ассоциированных с сайтами рестрикции (RAD) для быстрого картирования мутировавших локусов в Neurospora» . Генетика . 177 (2): 1163–1171. DOI : 10.1534 / genetics.107.078147 . PMC 2034621 . PMID 17660537 .  
  6. ^ a b Гогенлоэ П.А.; Bassham S; Etter PD; Ребро жесткости N; Джонсон Э.А.; Креско WA (2010). «Популяционная геномика параллельной адаптации трехиглой колюшки с использованием секвенированных меток RAD» . PLoS Genetics . 6 (2): e1000862. DOI : 10.1371 / journal.pgen.1000862 . PMC 2829049 . PMID 20195501 .  
  7. ^ a b Shendure J; Джи Х (2008). «Секвенирование ДНК нового поколения». Природа Биотехнологии . 26 : 1135–1145. DOI : 10.1038 / nbt1486 . PMID 18846087 . 
  8. ^ Hohenlohe PA; Bassham S; Etter PD; Ребро жесткости N; Джонсон Э.А.; Креско WA (2012). «Популяционная геномика параллельной адаптации трехигровой колюшки с использованием секвенированных тегов RAD» . PLOS ONE . 7 : e37135. DOI : 10.1371 / journal.pone.0037135 . PMC 3365034 . PMID 22675423 .