Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

В молекулярной биологии , полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ( ПДРФ ) представляет собой метод , который использует изменения в гомологичных ДНК последовательностей, известных как полиморфизмов , для того , чтобы различать отдельные лица, группы населения, или видов , или , чтобы точно определить местоположение генов в пределах срока sequence.The может относятся к самому полиморфизму, обнаруженному по разным местоположениям сайтов рестрикционных ферментов , или к соответствующей лабораторной методике, с помощью которой можно проиллюстрировать такие различия. В ПДРФ-анализе образец ДНК расщепляется на фрагменты одним или несколькими рестрикционными ферментами , и в результатеЗатем рестрикционные фрагменты разделяют гель-электрофорезом в соответствии с их размером.

Хотя в настоящее время в значительной степени устаревшие из-за появления недорогих технологий секвенирования ДНК , ПДРФ-анализ был первым достаточно недорогим методом профилирования ДНК , чтобы найти широкое применение. ПДРФ-анализ был важным ранним инструментом в картировании генома , локализации генов генетических нарушений , определении риска заболевания и проверке отцовства .

Анализ RFLP [ править ]

Основной метод обнаружения RFLP включает фрагментацию образца ДНК с применением рестрикционного фермента , который может выборочно расщеплять молекулу ДНК везде, где короткая конкретная последовательность распознается в процессе, известном как рестрикционный гидролизат . Фрагменты ДНК, полученные в результате переваривания, затем разделяют по длине с помощью процесса, известного как электрофорез в агарозном геле, и переносят на мембрану с помощью процедуры саузерн-блоттинга . Гибридизация мембраны с меченым ДНК-зондом затем определяет длину комплементарных фрагментов.к зонду. Считается, что полиморфизм длины рестрикционного фрагмента возникает, когда длина детектируемого фрагмента варьируется у разных индивидуумов, что указывает на неодинаковую гомологию последовательностей. Длина каждого фрагмента считается аллелем , независимо от того, содержит ли он кодирующую область или нет, и может использоваться в последующем генетическом анализе.

Схема для RFLP по потере сайта расщепления
Анализ и наследование аллельных фрагментов ПДРФ (NIH)
Схема для RFLP по вариации длины VNTR

Примеры [ править ]

Существует два общих механизма, с помощью которых может варьироваться размер конкретного рестрикционного фрагмента. На первой схеме небольшой сегмент генома обнаруживается ДНК-зондом (более толстая линия). В аллеле А геном расщепляется рестрикционным ферментом в трех соседних участках (треугольниках), но зондом будет обнаружен только крайний правый фрагмент. В аллеле а сайт рестрикции 2 был потерян в результате мутации , поэтому зонд теперь обнаруживает более крупный слитый фрагмент, проходящий от сайтов 1 до 3. Вторая диаграмма показывает, как это изменение размера фрагмента будет выглядеть на Саузерн-блоте и как каждый аллель (по два на человека) могут передаваться по наследству от членов семьи.

На третьей схеме зонд и рестрикционный фермент выбираются для обнаружения области генома, которая включает сегмент тандемного повтора с переменным числом (VNTR) (прямоугольники на схематической диаграмме). В аллеле c имеется пять повторов в VNTR, и зонд обнаруживает более длинный фрагмент между двумя сайтами рестрикции. В аллеле d есть только два повтора в VNTR, поэтому зонд обнаруживает более короткий фрагмент между теми же двумя сайтами рестрикции. Другие генетические процессы, такие как вставки , делеции , транслокации и инверсии , также могут приводить к полиморфизму. Для RFLP-тестов требуются гораздо большие образцы ДНК, чем для коротких тандемных повторов. (STR) тесты.

Приложения [ править ]

Анализ вариабельности ПДРФ в геномах раньше был жизненно важным инструментом в картировании генома и анализе генетических заболеваний. Если бы исследователи пытались первоначально определить хромосомное расположение гена определенного заболевания, они бы проанализировали ДНК членов семьи, пораженной этим заболеванием, и искали бы аллели RFLP, которые показывают аналогичный образец наследования, как у самого заболевания (см. генетическая связь ). Как только ген болезни был локализован, RFLP-анализ других семейств мог выявить, кто подвергался риску заболевания или кто мог быть носителем мутантных генов. RFLP-тест используется для идентификации и дифференциации организмов путем анализа уникальных паттернов в геноме. Он также используется для определения скорости рекомбинации в локусах между сайтами рестрикции.

Анализ ПДРФ был также основой для ранних методов генетического дактилоскопирования , полезных для идентификации образцов, взятых с мест преступлений , для определения отцовства и для характеристики генетического разнообразия или моделей размножения в популяциях животных.

Альтернативы [ править ]

Однако методика анализа RFLP медленная и громоздкая. Для этого требуется большое количество образца ДНК, а объединенный процесс маркировки зонда, фрагментации ДНК, электрофореза, блоттинга, гибридизации, промывки и авторадиографии может занять до месяца. Об ограниченной версии метода RFLP, в котором использовались олигонуклеотидные зонды, было сообщено в 1985 году. [1] Результаты проекта « Геном человека» в значительной степени заменили потребность в картировании RFLP и идентификации многих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в этом проекте. (а также прямая идентификация многих генов болезней и мутаций) заменила необходимость анализа связи заболеваний с помощью ПДРФ (см. генотипирование SNP). Анализ аллелей VNTR продолжается, но в настоящее время обычно выполняется методами полимеразной цепной реакции (ПЦР). Например, стандартные протоколы для снятия отпечатков пальцев ДНК включают ПЦР анализ панелей более чем дюжины VNTRs.

RFLP по-прежнему используется при отборе с помощью маркеров. Полиморфизм длины терминального рестрикционного фрагмента (TRFLP или иногда T-RFLP) - это метод, первоначально разработанный для характеристики бактериальных сообществ в смешанных образцах. Этот метод также применялся к другим группам, включая почвенные грибы. TRFLP работает путем ПЦР-амплификации ДНК с использованием пар праймеров, помеченных флуоресцентными метками. Затем продукты ПЦР расщепляют с использованием ферментов RFLP, и полученные картины визуализируются с помощью секвенатора ДНК. Результаты анализируются либо простым подсчетом и сравнением полос или пиков в профиле TRFLP, либо путем сопоставления полос из одного или нескольких прогонов TRFLP с базой данных известных видов. Методика в некоторых аспектах похожа на температурный градиент илиденатурирующий градиентный гель-электрофорез (TGGE и DGGE).

Изменения последовательности, непосредственно связанные с RFLP, также можно быстрее проанализировать с помощью ПЦР. Амплификация может быть направлена ​​через измененный сайт рестрикции, а продукты перевариваются рестрикционным ферментом. Этот метод получил название расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS). Альтернативно, амплифицированный сегмент можно анализировать с помощью зондов аллель-специфических олигонуклеотидов (ASO), процесс, который часто можно выполнить с помощью простого дот-блоттинга .

См. Также [ править ]

  • Полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP)
  • RAPD
  • STR анализ

Ссылки [ править ]

  1. ^ Saiki, R .; Шарф, S; Faloona, F; Mullis, K .; Рог, G .; Erlich, H .; Арнхейм, Н. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 (4732): 1350–1354. Bibcode : 1985Sci ... 230.1350S . DOI : 10.1126 / science.2999980 . ISSN  0036-8075 . PMID  2999980 .

Внешние ссылки [ править ]

  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml