Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Химическая структура красителей Hoechst.

Красители Hoechst являются частью семейства синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивания ДНК . [1] [2] Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны компанией Hoechst AG , которая пронумеровала все их соединения, так что краситель Hoechst 33342 стал 33 342-м составом, произведенным компанией. Есть три связанное пятно Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются те , наиболее часто используемыми , и они имеют схожие возбуждение - спектры излучения .

Молекулярные характеристики [ править ]

Спектры возбуждения-излучения красителей Хёхста.

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом с длиной волны около 350 нм , и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет вокруг максимума спектра излучения на 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальное излучение флуоресценции в диапазоне 510–540 нм. Пятна Hoechst можно возбудить ксеноновой или ртутной дуговой лампой или ультрафиолетовым лазером . Существует значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и испускания, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых используются несколько флуорофоров . Интенсивность флуоресценции Hoechst красители также возрастает с увеличением рН от растворителя. [3]

Красители Hoechst растворимы в воде и в органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Концентрация может достигать 10 мг / мл. Водные растворы стабильны при 2–6 ° C не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы замораживают при температуре –20 ° C или ниже. [3]

Hoechst 33258 (пурпурный) связан с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB : 264D .

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК с предпочтением последовательностей, богатых аденином и тимином . Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, богатые АТ двухцепочечные цепи ДНК значительно усиливают флуоресценцию. [4] Красители Hoechst проницаемы для клеток и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными , что означает, что живые клетки выживают после обработки этими соединениями. Клетки, которые экспрессируют специфические белки- переносчики АТФ-связывающих кассет, также могут активно транспортировать эти красители из своей цитоплазмы . [цитата необходима ]

Приложения [ править ]

Трансмиссионное изображение клеток HeLa с наложением окрашивания Hoechst 33258 (синий). Крайняя левая ячейка находится в прометафазах стадии митоза ; его хромосомы ярко флуоресцируют, потому что они содержат сильно уплотненную ДНК.
Флуоресцентное изображение культивированных нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец обрабатывали красителем Hoechst 33342, который используется для окрашивания ДНК. На снимке показано высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, что указывает на спонтанную активацию образования внеклеточных ловушек нейтрофилов у пациентов с БА, что обычно не наблюдается у здоровых партнеров.

Концентрация 0,1–12 мкг / мл обычно используется для окрашивания ДНК в клетках бактерий или эукариот . Клетки окрашивают в течение 1-30 мин при комнатной температуре или 37 ° C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зеленая флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых. [3] Красители Hoechst часто используются как заменители другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI .

Ключевые различия между красителями Hoechst и DAPI:

  • Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток [5]
  • Дополнительная этильная группа красителей Hoechst делает их более проницаемыми для клеток. [ необходима цитата ]
  • Существуют красители, окрашивающие ядра, которые обеспечивают жизнеспособность клеток после окрашивания. [ необходима цитата ]

Hoechst 33342 и 33258 являются гасили путем бромдеоксиуридина (BrdU), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую проницаемость для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве заменителя тимидина . Когда BrdU интегрируется в ДНК, предполагается, что бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Связывание красителей Hoechst даже сильнее с BrdU-замещенной ДНК; однако флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга развития клеточного цикла . [6] [7]

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих областях:

  • Флуоресцентная микроскопия и иммуногистохимия , часто с другими флуорофорами [8]
  • Проточная цитометрия для подсчета или сортировки клеток. Примером может служить использование красителей Hoechst для анализа того, сколько клеток популяции находится в какой фазе клеточного цикла [9]
  • Обнаружение ДНК в присутствии РНК в агарозных гелях [10]
  • Автоматическое определение ДНК [11]
  • Сортировка хромосом [10]

Отток Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выводить краситель, они могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции . Это делается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным хехстом, через красный и синий фильтры и нанесением красных и синих хехстов друг на друга. [ необходима цитата ]

Токсичность и безопасность [ править ]

Поскольку красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время деления клеток . Следовательно, они потенциально мутагенные и канцерогенные , поэтому следует соблюдать осторожность при обращении с ними и их утилизации. Окраска Hoechst используется для сортировки спермы у скота и людей. Его безопасность обсуждалась. [12] [13]

См. Также [ править ]

  • Бисбензимид
  • Канцероген
  • DAPI
  • ДНК-связывающий белок
  • Возбужденное состояние
  • Флуоресценция
  • Флуоресцентная микроскопия
  • Флуорофор
  • Проточной цитометрии
  • Hoechst AG
  • Иммуногистохимия
  • Лекситропсин
  • Малая канавка
  • Мутаген
  • Нетропсин
  • Сравнение программного обеспечения для моделирования нуклеиновых кислот
  • Пентамидин
  • Тушение (флуоресценция)
  • Стоксов сдвиг

Ссылки [ править ]

  1. ^ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Уиллард, ВЧ; Scher, CD (июль 1975 г.). «Последние разработки в области обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью флуоресценции 33258 Hoechst» . Журнал гистохимии и цитохимии . 23 (7): 493–505. DOI : 10.1177 / 23.7.1095650 . PMID  1095650 .
  2. ^ Latt, SA; Стеттен, Г. (январь 1976 г.). «Спектральные исследования 33258 Hoechst и родственных бисбензимидазольных красителей, полезных для флуоресцентного обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты» . Журнал гистохимии и цитохимии . 24 (1): 24–33. DOI : 10.1177 / 24.1.943439 . PMID 943439 . 
  3. ^ a b c "Пятна Hoechst" (PDF) . Инвитрогрен (молекулярные зонды). Архивировано из оригинального (PDF) 19 апреля 2009 года.
  4. ^ Португалия, J; Уоринг, MJ (28 февраля 1988 г.). «Назначение сайтов связывания ДНК для 4 ', 6-диамидин-2-фенилиндола и бисбензимида (Hoechst 33258). Сравнительное исследование отпечатков пальцев». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура и экспрессия гена . 949 (2): 158–68. DOI : 10.1016 / 0167-4781 (88) 90079-6 . PMID 2449244 . 
  5. ^ BD Bioscience (2009). Методы анализа иммунной функции (PDF) (2-е изд.). Бектон, Дикинсон и компания.
  6. ^ Кубби, М; Рабинович, П.С. (январь 1983 г.). «Проточный цитометрический анализ факторов, которые влияют на эффект тушения BrdUrd-Hoechst в культивируемых фибробластах и ​​лимфоцитах человека». Цитометрия . 3 (4): 276–81. DOI : 10.1002 / cyto.990030408 . PMID 6185287 . 
  7. ^ Breusegem, SY; Клегг, РМ; Loontiens, FG (1 февраля 2002 г.). «Специфичность базовой последовательности Hoechst 33258 и связывание DAPI с пятью (A / T) 4 участками ДНК с кинетическими доказательствами для более чем одного высокоаффинного комплекса Hoechst 33258-AATT». Журнал молекулярной биологии . 315 (5): 1049–61. DOI : 10.1006 / jmbi.2001.5301 . PMID 11827475 . 
  8. ^ Иэн Джонсон, Мишель Т.З. Спенс, изд. (2011). Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки (11-е изд.). Invitrogen. ISBN 978-0-9829279-1-5.
  9. ^ Kubbies, М (1990). «Проточно-цитометрическое распознавание кластоген-индуцированного повреждения хроматина в лимфоцитах G0 / G1 путем нестехиометрического связывания флуорохрома Hoechst» . Цитометрия . 11 (3): 386–94. DOI : 10.1002 / cyto.990110309 . PMID 1692786 . 
  10. ^ a b Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (23 декабря 1987 г.). «Новый чувствительный метод флуориметрического окрашивания для обнаружения ДНК в препаратах РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 15 (24): 10589. DOI : 10,1093 / NAR / 15.24.10589 . PMC 339970 . PMID 2447564 .  
  11. ^ Sterzel, W; Бедфорд, П.; Айзенбранд, Г. (июнь 1985 г.). «Автоматическое определение ДНК с использованием флуорохрома Hoechst 33258». Аналитическая биохимия . 147 (2): 462–7. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (85) 90299-4 . PMID 2409841 . 
  12. ^ Ashwood-Смит, MJ (1994). «Безопасность отбора спермы человека методом проточной цитометрии» . Репродукция человека . Издательство Оксфордского университета . 9 (5): 757–759. DOI : 10.1093 / oxfordjournals.humrep.a138589 . PMID 7929716 . 
  13. ^ Parrilla, I; Васкес, JM; Cuello, C; Гил, Массачусетс; Рока, Дж; Ди Берардино, Д; Мартинес, EA (2004). «Окрашивание Hoechst 33342 и воздействие УФ-лазера не вызывают генотоксических эффектов в отсортированных по потоку сперматозоидах хряков» . Репродукция . 128 (5): 615–621. DOI : 10,1530 / rep.1.00288 . PMID 15509707 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Спектральные следы флуоресцентных красителей
  • Инструкция по удалению пятен Hoechst
  • Онлайн-руководство по флуоресцентным зондам и коммерческим технологиям маркировки