Мечение иммунным золотом или окрашивание иммунным золотом (IGS) - это метод окрашивания, используемый в электронной микроскопии . [2] Этот метод окрашивания является эквивалентом метода непрямой иммунофлуоресценции для видимого света. Частицы коллоидного золота чаще всего прикрепляются к вторичным антителам, которые, в свою очередь, прикрепляются к первичным антителам, предназначенным для связывания определенного антигена или другого компонента клетки . Золото используется из-за его высокой электронной плотности, которая увеличивает рассеяние электронов, создавая высококонтрастные «темные пятна». [3]
Впервые примененное в 1971 году мечение иммунозолотом применялось как в просвечивающей электронной микроскопии, так и в сканирующей электронной микроскопии , а также в светлопольной микроскопии . Техника маркировки может быть адаптирована для различения нескольких объектов с помощью золотых частиц разного размера.
Мечение иммуноголдом может привести к появлению артефактов, поскольку частицы золота находятся на некотором расстоянии от помеченного объекта, и во время подготовки образца требуется очень тонкое срезы. [3]
История
Мечение иммунным золотом было впервые использовано в 1971 году Фолком и Тейлором для идентификации антигенов сальмонелл . [2] [4] Впервые он был применен в просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и был особенно полезен для выделения белков с низкой плотностью, таких как некоторые антигены клеточной поверхности. [5] По мере того, как разрешение сканирующей электронной микроскопии (SEM) увеличивалось, росла и потребность в метках размером с наночастицы, таких как иммунозолото. В 1975 году Хорисбергер и его коллеги успешно визуализировали наночастицы золота диаметром менее 30 нм [6], и вскоре это стало общепринятой техникой СЭМ. [5]
Техника
Сначала вырезается тонкий срез образца, часто с помощью микротома . [7] Затем могут иметь место различные другие этапы подготовки образца .
Подготовленный образец затем инкубируют со специфическим антителом, предназначенным для связывания интересующей молекулы. [3] Затем добавляется вторичное антитело, к которому прикреплены частицы золота, и оно связывается с первичным антителом. Золото также может быть присоединено к белку А или белку G вместо вторичного антитела, поскольку эти белки связывают Fc-области IgG млекопитающих неспецифическим образом. [6]
Электронно-плотную частицу золота теперь можно увидеть под электронным микроскопом в виде черной точки, косвенно маркирующей интересующую молекулу. [3]
Маркировка нескольких объектов
Мечение Immunogold можно использовать для одновременной визуализации более чем одной мишени. Этого можно достичь в электронной микроскопии , используя две золотые частицы разного размера. [8] Расширение этого метода использовало три частицы золота разного размера для отслеживания локализации регуляторных пептидов . [9] Более сложный метод мультисайтового мечения включает мечение противоположных сторон антигенного сайта по отдельности, после чего частицы иммунного золота, прикрепленные к обеим сторонам, могут быть просмотрены одновременно. [10]
Использование в светлопольной микроскопии
Хотя мечение иммунным золотом обычно используется для просвечивающей электронной микроскопии, когда золото «усилено серебром», это можно увидеть с помощью микроскопии в светлом поле . [11] Увеличение серебра увеличивает размер частиц, что также делает возможной сканирующую электронную микроскопию. Чтобы получить частицы золота с усиленным серебром, частицы коллоидного золота помещают в кислотный усиливающий раствор, содержащий ионы серебра . Затем частицы золота действуют как центр зародышеобразования, и на частицу осаждается серебро. Примером применения мечения иммунозолотом, усиленного серебром (IGSS), была идентификация патогена Erwinia amylovora . [11]
Ограничения
Неотъемлемым ограничением метода иммунного золота является то, что золотая частица находится на расстоянии около 15-30 нм от сайта, с которым связано первичное антитело [5] (при использовании стратегии мечения первичных и вторичных антител ). Поэтому точное местоположение целевой молекулы невозможно точно рассчитать. Золотые частицы могут быть созданы с диаметром 1 нм (или меньше), но тогда реализуется другое ограничение - при таких размерах золотую метку становится трудно отличить от структуры ткани. [2] [5]
Для маркировки иммунозолотом требуются тонкие срезы, которые могут создавать искажающие изображения; тонкий срез клеточного компонента может не дать точного представления о его трехмерной структуре . Например, микротрубочка может выглядеть как «шип» в зависимости от того, в какой плоскости произошло рассечение. Чтобы преодолеть это ограничение, могут быть взяты серийные секции, которые затем могут быть скомпилированы в трехмерное изображение. [3]
Еще одним ограничением является то, что антитела и частицы золота не могут проникнуть через смолу, используемую для заделки образцов для визуализации. Таким образом, могут быть нацелены и визуализированы только доступные молекулы. Маркировка перед заливкой образца может снизить негативное влияние этого ограничения. [3]
Смотрите также
- Иммуногистохимия
Рекомендации
- ^ Iborra FJ, Кимура H, Кук PR (2004). «Функциональная организация митохондриальных геномов в клетках человека» . BMC Biol. 2 : 9. DOI : 10.1186 / 1741-7007-2-9 . PMC 425603 . PMID 15157274 .
- ^ а б в «Мечение иммунным золотом в сканирующей электронной микроскопии» . Архивировано из оригинала на 2014-02-06 . Проверено 8 июля 2010 .
- ^ а б в г д е Альбертс, Брюс; и другие. (2008). Молекулярная биология клетки (5-е изд.). Нью-Йорк: Наука о гирляндах. ISBN 978-0-8153-4106-2.
- ^ Фолк В.П., Тейлор GM (ноябрь 1971 г.). «Иммуноколлоидный метод для электронного микроскопа». Иммунохимия . 8 (11): 1081–3. DOI : 10.1016 / 0019-2791 (71) 90496-4 . PMID 4110101 .
- ^ а б в г Германн Р., Вальтер П., Мюллер М. (1996). «Мечение иммунозолотом в сканирующей электронной микроскопии». Гистохимия и клеточная биология . 106 (1): 31–39. DOI : 10.1007 / BF02473200 . PMID 8858365 .
- ^ а б Рот Дж., Бендаян М., Орчи Л. (декабрь 1978 г.). «Ультраструктурная локализация внутриклеточных антигенов с помощью комплекса протеин А-золото» . J. Histochem. Cytochem . 26 (12): 1074–81. DOI : 10.1177 / 26.12.366014 . PMID 366014 . Архивировано из оригинала на 2008-09-07 . Проверено 8 июля 2010 .
- ^ Портер, К; Блюм, Дж (1953). «Исследование микротомии для электронной микроскопии». Анатомическая запись . 117 (4): 685–710. DOI : 10.1002 / ar.1091170403 . PMID 13124776 .
- ^ Рот Дж., Биндер М (март 1978 г.). «Колоидное золото, ферритин и пероксидаза в качестве маркеров для методов электронной микроскопии лектинов с двойной меткой» . J. Histochem. Cytochem . 26 (3): 163–9. DOI : 10.1177 / 26.3.632554 . PMID 632554 . Проверено 18 июля 2010 .[ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ Тапиа Ф.Дж., Варнделл И.М., Проберт Л., Де Мей Дж., Полак Дж. М. (июль 1983 г.). «Метод двойного иммунного окрашивания золотом для одновременной ультраструктурной локализации регуляторных пептидов» . J. Histochem. Cytochem . 31 (7): 977–81. DOI : 10.1177 / 31.7.6189888 . PMID 6189888 . Проверено 18 июля 2010 .[ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ Бендаян М. (январь 1982 г.). «Двойное иммуноцитохимическое мечение с применением метода протеина А-золота» . J. Histochem. Cytochem . 30 (1): 81–5. DOI : 10.1177 / 30.1.6172469 . PMID 6172469 . Проверено 18 июля 2010 .[ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ а б Ван Лаэр О., Де Ваэль Л., Де Мей Дж. (1985). «Иммуно-золотое окрашивание (IGS) и иммуно-золотое окрашивание (IGSS) для идентификации патогенной бактерии растений Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al». Гистохимия . 83 (5): 397–9. DOI : 10.1007 / BF00509198 . PMID 2416717 .