Иммунофлуоресценция - это метод, используемый для световой микроскопии с помощью флуоресцентного микроскопа и используется в основном для микробиологических образцов. Этот метод использует специфичность антител к их антигену для нацеливания флуоресцентных красителей на конкретные биомолекулы- мишени внутри клетки и, следовательно, позволяет визуализировать распределение целевой молекулы в образце. Специфическая область, которую антитело распознает на антигене, называется эпитопом. [1]Были предприняты попытки картирования эпитопов, поскольку многие антитела могут связывать один и тот же эпитоп, и уровни связывания между антителами, распознающими один и тот же эпитоп, могут варьироваться. [2] Кроме того, связывание флуорофора с антителом само по себе не может влиять на иммунологическую специфичность антитела или связывающую способность его антигена. [3] Иммунофлуоресценция - широко используемый пример иммуноокрашивания (с использованием антител для окрашивания белков) и конкретный пример иммуногистохимии (использование взаимосвязи антитело-антиген в тканях). Этот метод в первую очередь использует флуорофоры для визуализации местоположения антител. [4]
Иммунофлуоресценция может использоваться на срезах тканей, культивируемых клеточных линиях или отдельных клетках и может использоваться для анализа распределения белков , гликанов и небольших биологических и небиологических молекул. Этот метод можно использовать даже для визуализации таких структур, как волокна среднего размера. [5] Если топология клеточной мембраны еще не определена, вставку эпитопа в белки можно использовать в сочетании с иммунофлуоресценцией для определения структур. [6] Иммунофлуоресценция также может использоваться как «полуколичественный» метод для понимания уровней и паттернов локализации метилирования ДНК, поскольку это более трудоемкий метод, чем истинные количественные методы, и есть некоторая субъективность в анализе уровни метилирования. [7] Иммунофлуоресценцию можно использовать в сочетании с другими методами флуоресцентного окрашивания, не связанными с антителами, например, с использованием DAPI для мечения ДНК . Для анализа иммунофлуоресцентных образцов можно использовать несколько конструкций микроскопов; Самым простым из них является эпифлуоресцентный микроскоп , также широко используется конфокальный микроскоп . Также можно использовать различные конструкции микроскопов сверхвысокого разрешения , которые обеспечивают гораздо более высокое разрешение. [8]
Типы
Подготовка к флуоресценции
Чтобы получить антитела, меченные флуорохромом, флуорохром должен быть конъюгирован («помечен») с антителом. Аналогичным образом, антиген также может быть конъюгирован с антителом с помощью флуоресцентного зонда с помощью метода, называемого методом флуоресцентного антигена. Процедуры окрашивания могут применяться как к фиксированному антигену в цитоплазме, так и к антигенам клеточной поверхности живых клеток, что называется «иммунофлуоресценцией мембраны». Также возможно пометить комплемент комплекса антитело-антиген флуоресцентным зондом. Помимо элемента, к которому прикреплены флуоресцентные зонды, существует два основных класса иммунофлуоресцентных методов: первичные и вторичные. Следующие ниже описания будут сосредоточены в первую очередь на этих классах с точки зрения конъюгированных антител. [3]
Существует два класса иммунофлуоресцентных методов: первичные (или прямые) и вторичные (или непрямые).
Первичный (прямой)
Первичная (прямая) иммунофлуоресценция использует одно первичное антитело, химически связанное с флуорофором . Первичное антитело распознает целевую молекулу (антиген) и связывается с определенной областью, называемой эпитопом. Это достигается с помощью процесса, который манипулирует иммунным ответом организма с помощью адаптивного иммунитета. Присоединенный флуорофор можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии, которая, в зависимости от используемого мессенджера, при возбуждении будет излучать свет определенной длины волны. [9] Прямая иммунофлуоресценция, хотя и менее распространена, имеет заметные преимущества перед вторичной (непрямой) процедурой. Прямое прикрепление мессенджера к антителу сокращает количество этапов процедуры, экономя время и уменьшая неспецифический фоновый сигнал. [10] Это также ограничивает возможность перекрестной реактивности антител и возможных ошибок на протяжении всего процесса. Однако у этого метода есть некоторые недостатки. Поскольку количество флуоресцентных молекул, которые могут быть связаны с первичным антителом, ограничено, прямая иммунофлуоресценция существенно менее чувствительна, чем непрямая иммунофлуоресценция, и может давать ложноотрицательные результаты. Прямая иммунофлуоресценция также требует использования гораздо большего количества первичных антител, что чрезвычайно дорого, иногда до 400 долларов США / мл.
Вторичный (косвенный)
Вторичная (непрямая) иммунофлуоресценция использует два антитела; немеченое первое (первичное) антитело специфически связывает молекулу-мишень, а вторичное антитело, несущее флуорофор, распознает первичное антитело и связывается с ним. Множественные вторичные антитела могут связывать одно первичное антитело. Это обеспечивает усиление сигнала за счет увеличения количества молекул флуорофора на антиген. [10] Этот протокол более сложен и требует много времени, чем первичный (или прямой) протокол, описанный выше, но обеспечивает большую гибкость, поскольку для данного первичного антитела можно использовать множество различных вторичных антител и методов обнаружения. [10]
Этот протокол возможен, потому что антитело состоит из двух частей: вариабельной области (которая распознает антиген) и константной области (которая составляет структуру молекулы антитела). Важно понимать, что это деление является искусственным, и на самом деле молекула антитела состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Исследователь может создать несколько первичных антител, которые распознают различные антигены (имеют разные вариабельные области), но все они имеют одну и ту же константную область. Следовательно, все эти антитела могут распознаваться одним вторичным антителом. Это экономит затраты на модификацию первичных антител для прямого переноса флуорофора.
Различные первичные антитела с разными константными областями обычно генерируются путем повышения уровня антител у разных видов. Например, исследователь может создать у козы первичные антитела, которые распознают несколько антигенов, а затем использовать связанные с красителем вторичные антитела кролика, которые распознают константную область козьих антител («кроличьи антикозьи» антитела). Затем исследователь может создать второй набор первичных антител у мыши, который может распознаваться отдельным вторичным антителом «ослиные антимышиные». Это позволяет повторно использовать сложные для изготовления антитела, связанные с красителем, в нескольких экспериментах.
Ограничения
Как и в случае с большинством методов флуоресценции, существенной проблемой иммунофлуоресценции является фотообесцвечивание . Снижение активности, вызванное фотообесцвечиванием, можно контролировать, уменьшая или ограничивая интенсивность или продолжительность воздействия света, увеличивая концентрацию флуорофоров или используя более надежные флуорофоры, которые менее склонны к обесцвечиванию (например, Alexa Fluors , Seta Fluors , или DyLight Fluors ). Некоторые проблемы, которые могут возникнуть при использовании этого метода, включают автофлуоресценцию, постороннюю нежелательную специфическую флуоресценцию и неспецифическую флуоресценцию. Автофлуоресценция включает флуоресценцию, испускаемую самой тканью или клеткой образца. Посторонняя нежелательная специфическая флуоресценция возникает, когда целевой антиген не чистый и содержит антигенные примеси. Неспецифическая флуоресценция связана с потерей специфичности зонда из-за флуорофора, из-за неправильной фиксации или из-за высыхания образца. [3]
Иммунофлуоресценция ограничивается только фиксированными (т. Е. Мертвыми) клетками, когда структуры внутри клетки должны быть визуализированы, поскольку антитела не проникают через клеточную мембрану при взаимодействии с флуоресцентными метками. Антигенный материал должен прочно фиксироваться на месте его естественного локализации внутри клетки. [3] Интактные антитела также могут быть слишком большими, чтобы окрашивать раковые клетки in vivo . [11] Их размер приводит к медленному проникновению в опухоль и длительному периоду полужизни в кровотоке. Было проведено исследование использования диател для обхода этого ограничения. [11] Белки в супернатанте или вне клеточной мембраны могут связываться с антителами; это позволяет окрашивать живые клетки. В зависимости от используемого фиксатора, представляющие интерес белки могут стать перекрестно-связанными, и это может привести к ложноположительным или ложноотрицательным сигналам из-за неспецифического связывания.
Альтернативный подход заключается в использовании рекомбинантных белков, содержащих домены флуоресцентных белков, например зеленого флуоресцентного белка (GFP). Использование таких «меченых» белков позволяет определить их локализацию в живых клетках. Несмотря на то, что это кажется изящной альтернативой иммунофлуоресценции, клетки должны быть трансфицированы или трансдуцированы с помощью GFP-метки, и, как следствие, они становятся организмами, по крайней мере, S1 или выше, которые требуют более строгих стандартов безопасности в лаборатории. Этот метод включает изменение генетической информации клеток. [12]
Достижения
Многие улучшения этого метода заключаются в улучшении флуоресцентных микроскопов и флуорофоров. Методы сверхвысокого разрешения обычно относятся к способности микроскопа обеспечивать разрешение ниже предела Аббе (предел, налагаемый на свет из-за его длины волны). Этот дифракционный предел составляет примерно 200-300 нм в поперечном направлении и 500-700 нм в осевом направлении. Этот предел сопоставим или больше, чем некоторые структуры в клетке, и, следовательно, этот предел не позволял ученым определить детали их структуры. [13] Сверхразрешение флуоресценции, более конкретно, относится к способности микроскопа предотвращать одновременную флуоресценцию соседних спектрально идентичных флуорофоров. [14] Этот процесс эффективно улучшает функцию рассеяния точки микроскопа. [13] Примеры недавно разработанных методов флуоресцентного микроскопа сверхвысокого разрешения включают микроскопию истощения с использованием стимулированного излучения (STED), микроскопию с насыщенным структурированным освещением (SSIM), микроскопию локализации флуоресцентной фотоактивации (FPALM) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM). [15]
Смотрите также
- Кожные заболевания по данным иммунофлуоресценции
- Иммунохимия
- Патч и укупорка
Рекомендации
- ^ Мандрелл, RE; Гриффисс, Дж. М.; Машер, BA (1988-07-01). «Липоолигосахариды (LOS) Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis имеют компоненты, иммунохимически подобные предшественникам антигенов группы крови человека. Специфичность углеводной последовательности моноклональных антител мыши, которые распознают перекрестно реагирующие антигены на LOS и эритроцитах человека» . Журнал экспериментальной медицины . 168 (1): 107–126. DOI : 10.1084 / jem.168.1.107 . ISSN 0022-1007 . PMC 2188965 . PMID 2456365 .
- ^ Ladner, Роберт К. (2007-01-01). «Картирование эпитопов антител». Обзоры биотехнологии и генной инженерии . 24 (1): 1–30. CiteSeerX 10.1.1.536.6172 . DOI : 10.1080 / 02648725.2007.10648092 . ISSN 0264-8725 .
- ^ а б в г Акиёси., Кавамура (1 января 1983 г.). Иммунофлуоресценция в медицине: с 28 таб . Springer ua ISBN 978-3540124832. OCLC 643714056 .
- ^ «Иммунофлуоресценция» . Протокол онлайн .
- ^ Franke, WW; Schmid, E .; Осборн, М .; Вебер, К. (1978-10-01). «Различные нити среднего размера, различимые с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (10): 5034–5038. DOI : 10.1073 / pnas.75.10.5034 . ISSN 0027-8424 . PMC 336257 . PMID 368806 .
- ^ Ван, Хунган; Ли, Ын-Ву; Цай, Сяокунь; Ни, Чжанлинь; Чжоу, Линь; Мао Цинчэн (30 декабря 2008 г.). «Мембранная топология белка устойчивости к раку молочной железы человека (BCRP / ABCG2), определяемая вставкой эпитопа и иммунофлуоресценцией» . Биохимия . 47 (52): 13778–13787. DOI : 10.1021 / bi801644v . ISSN 0006-2960 . PMC 2649121 . PMID 19063604 .
- ^ Челик, Селцен (01.01.2015). «Понимание сложности восстановления антигена метилирования ДНК для измерения на основе иммунофлуоресценции и подход к решению проблемы». Журнал иммунологических методов . 416 : 1–16. DOI : 10.1016 / j.jim.2014.11.011 . PMID 25435341 .
- ^ «Метод иммунофлуоресценции» . Дэвидсон-колледж.
- ^ «Методы иммуногистохимического окрашивания» (PDF) . Руководство IHC (Шестое изд.). Dako Denmark A / S, компания Agilent Technologies. 2013.
- ^ а б в Fritschy J, Härtig W (2001). Иммунофлуоресценция . eLS . DOI : 10.1038 / npg.els.0001174 .
- ^ а б Сонн Г.А., Бехеснилиан А.С., Цзян З.К., Зеттлитц К.А., Лепин Э.Дж., Бентолила Л.А., Ноулз С.М., Лоуренс Д., Ву А.М., Рейтер Р.Э. (2016). «Флуоресцентная хирургия под контролем изображения с диателом против антигена стволовых клеток простаты (PSCA) делает возможным прицельную резекцию ксенотрансплантатов рака предстательной железы мыши в режиме реального времени» . Клинические исследования рака . 22 (6): 1403–12. DOI : 10.1158 / 1078-0432.CCR-15-0503 . PMC 4794340 . PMID 26490315 .
- ^ Чалфи, Мартин (1995-10-01). «Зеленый флуоресцентный белок». Фотохимия и фотобиология . 62 (4): 651–656. DOI : 10.1111 / j.1751-1097.1995.tb08712.x . ISSN 1751-1097 .
- ^ а б Хуанг, Бо; Бейтс, Марк; Чжуан, Сяовэй (02.06.2009). «Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения» . Ежегодный обзор биохимии . 78 : 993–1016. DOI : 10.1146 / annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776 . PMID 19489737 .
- ^ 1959 г. - Диаспро, Альберто; Ван, Зандвоорт, Марк AMJ (2016-11-03). Визуализация сверхвысокого разрешения в биомедицине . ISBN 9781482244359. OCLC 960719686 .CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
- ^ Люнг, Бонни О .; Чжоу, Кенг К. (01.09.2011). "Обзор флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения для биологии" . Прикладная спектроскопия . 65 (9): 967–980. DOI : 10.1366 / 11-06398 . ISSN 0003-7028 . PMID 21929850 .
Внешние ссылки
- Изображения, связанные с аутоиммунными заболеваниями в Университете Бирмингема
- Протокол иммунофлуоресцентного окрашивания
- Обзор в Davidson College
- Иммунофлуоресценция в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- SynD - автоматическое обнаружение синапсов и нейритов на иммунофлуоресцентных изображениях