Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Ион полупроводниковое секвенирование представляет собой метод секвенирования ДНК на основе обнаружения ионов водорода , которые высвобождаются во время полимеризации в ДНК . Это метод «секвенирования путем синтеза», в ходе которого комплементарная цепь строится на основе последовательности матричной цепи.

Полупроводниковый секвенсор Ion Proton

Микролунка, содержащая цепочку матричной ДНК, подлежащую секвенированию, заполняется одним видом дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP). Если введенный dNTP комплементарен ведущему нуклеотиду матрицы, он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение иона водорода, который запускает датчик ионов ISFET , что указывает на то, что произошла реакция. Если в матричной последовательности присутствуют гомополимерные повторы, несколько молекул dNTP будут включены в один цикл. Это приводит к соответствующему количеству выделившихся водородов и пропорционально более высокому электронному сигналу.

Эта технология отличается от других технологий секвенирования путем синтеза тем, что не используются модифицированные нуклеотиды или оптика . Ионно-полупроводниковое секвенирование может также называться секвенированием ионного потока, pH-опосредованным секвенированием, кремниевым секвенированием или полупроводниковым секвенированием.

История развития технологий [ править ]

Технология была лицензирована у компании DNA Electronics Ltd [1] [2], разработанной Ion Torrent Systems Inc. и выпущенной в феврале 2010 года. [3] Ion Torrent представила свою машину как быстрый, компактный и экономичный секвенсор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольной машины. [4] Компания Roche 454 Life Sciences сотрудничает с компанией DNA Electronics в разработке платформы для долгого считывания и высокоплотного секвенирования полупроводников с использованием этой технологии. [5]

Технология [ править ]

подпись
Включение дезоксирибонуклеотидтрифосфата в растущую цепь ДНК вызывает высвобождение водорода и пирофосфата.
подпись
Высвобождение ионов водорода указывает, были ли включены ноль, один или несколько нуклеотидов.
подпись
Высвобожденные ионы водорода обнаруживаются ионным датчиком. Множественные включения приводят к соответствующему количеству высвобождаемых водородов и интенсивности сигнала.

Секвенирование химии [ править ]

В природе включение дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP) в растущую цепь ДНК включает образование ковалентной связи и высвобождение пирофосфата и положительно заряженного иона водорода . [1] [3] [6] dNTP будет включен только в том случае, если он комплементарен ведущему неспаренному матричному нуклеотиду. Ионно-полупроводниковое секвенирование использует эти факты, определяя, высвобождается ли ион водорода при введении в реакцию одного вида dNTP.

Микролунки на полупроводниковом чипе , каждая из которых содержит множество копий одной одноцепочечной матричной молекулы ДНК, подлежащей секвенированию, и ДНК-полимеразы последовательно заполняются немодифицированными A, C, G или T dNTP. [3] [7] [8] Если введенный dNTP комплементарен следующему неспаренному нуклеотиду на матричной цепи, он включается в растущую комплементарную цепь ДНК-полимеразой. [9] Если введенный dNTP не является комплементарным, не происходит включения и биохимической реакции. Ион водорода, который высвобождается в результате реакции, изменяет pH раствора, который определяется ISFET . [1] [3][7] Неприкрепленные молекулы dNTP вымываются перед следующим циклом, когда вводится другой вид dNTP. [7]

Обнаружение сигнала [ править ]

Под слоем микролунок находится ионно-чувствительный слой, под которым находится ионный датчик ISFET . [4] Все слои содержатся в полупроводниковом кристалле CMOS , аналогичном тому, который используется в электронной промышленности. [4] [10]

Каждый чип содержит набор микролунок с соответствующими детекторами ISFET . [7] Каждый высвободившийся ион водорода запускает датчик ионов ISFET . Последовательность электрических импульсов, передаваемых от чипа к компьютеру, преобразуется в последовательность ДНК, без необходимости промежуточного преобразования сигнала. [7] [11] Поскольку события включения нуклеотидов измеряются непосредственно электроникой, использование меченых нуклеотидов и оптических измерений не допускается. [4] [10] Обработка сигналов и сборка ДНК могут быть выполнены в программном обеспечении.

Характеристики секвенирования [ править ]

Базовая точность, достигнутая компанией Ion Torrent на полупроводниковом секвенсоре Ion Torrent Ion по состоянию на февраль 2011 года, составила 99,6% на основе 50 базовых чтений со 100 Мбайт за прогон. [12] Длина чтения по состоянию на февраль 2011 года составляла 100 пар оснований . [12] Точность для гомополимерных повторов длиной 5 повторов составила 98%. [12] Более поздние версии показывают, что длина чтения составляет 400 пар оснований. [13] Эти цифры еще не были проверены независимыми организациями.

Сильные стороны [ править ]

Основными преимуществами ионно-полупроводникового секвенирования являются быстрая скорость секвенирования и низкие первоначальные и эксплуатационные расходы. [8] [11] Это стало возможным благодаря отказу от модифицированных нуклеотидов и оптических измерений.

Поскольку система регистрирует события включения нуклеотидов, опосредованные естественной полимеразой, секвенирование может происходить в режиме реального времени. В действительности скорость секвенирования ограничивается циклическим циклом нуклеотидов субстрата в системе. [14] Ion Torrent Systems Inc., разработчик технологии, утверждает, что каждое измерение включения занимает 4 секунды, а каждый запуск занимает около часа, в течение которого секвенируются 100-200 нуклеотидов. [11] [15] Если полупроводниковые микросхемы улучшаются (как предсказывает закон Мура ), количество считываний на микросхему (и, следовательно, на прогон) должно увеличиться. [11]

Стоимость приобретения pH-опосредованного секвенатора от Ion Torrent Systems Inc. на момент запуска оценивалась примерно в 50 000 долларов США, без учета оборудования для подготовки проб и сервера для анализа данных. [8] [11] [15] Стоимость одного цикла также значительно ниже, чем у альтернативных методов автоматического секвенирования, примерно 1000 долларов США. [8] [12]

Ограничения [ править ]

Если гомополимер повторяет один и тот же нуклеотид (например,TTTTT) присутствуют на цепочке-шаблоне (цепочке, которая должна быть секвенирована), то встраиваются несколько введенных нуклеотидов, и за один цикл высвобождается больше ионов водорода. Это приводит к большему изменению pH и пропорционально большему электронному сигналу. [11] Это ограничение системы в том, что трудно перечислить длинные повторы. Это ограничение присуще и другим методам обнаружения добавлений единичных нуклеотидов, таким как пиросеквенирование . [16] Сигналы, генерируемые большим числом повторов, трудно отличить от повторов аналогичного, но другого числа; напр. , гоморепиты длиной 7 трудно отличить от гомореповатов длины 8.

Еще одним ограничением этой системы является малая длина считывания по сравнению с другими методами секвенирования, такими как секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование . Более длинные чтения полезны для сборки генома de novo . Полупроводниковые секвенаторы Ion Torrent производят среднюю длину считывания примерно 400 нуклеотидов за одно считывание. [3] [8]

Пропускная способность в настоящее время ниже, чем у других высокопроизводительных технологий секвенирования, хотя разработчики надеются изменить это, увеличив плотность чипа . [3]

Заявление [ править ]

Разработчики полупроводникового секвенсора Ion Torrent представили его как быстрый, компактный и экономичный секвенатор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольного устройства. [3] [4] Компания надеется, что их система перенесет секвенирование за пределы специализированных центров в больницы и небольшие лаборатории. [17] В статье New York Times, опубликованной в январе 2011 г., «Распространение секвенирования ДНК в массы» подчеркиваются эти амбиции. [17]

Благодаря способности альтернативных методов секвенирования достичь большей длины чтения (и, следовательно, больше подходит для анализа всего генома ), эта технология может лучше всего подходить для небольших приложений, таких как секвенирование микробного генома, секвенирование микробного транскриптома , целевое секвенирование, секвенирование ампликона. , или для проверки качества библиотек секвенирования. [3] [8] [18]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Мир Bio-IT, Дэвис, К. Превентивная медицина в действие . Мир биотехнологий 2011
  2. ^ GenomeWeb ДНК-электроника лицензирует IP для Ion Torrent . Август 2010 г.
  3. ^ Б с д е е г ч Раск, N. (2011). «Торренты последовательности» . Нат Мет 8 (1): 44-44.
  4. ^ a b c d e Официальная веб-страница Ion Torrent. Архивировано 6 ноября 2012 г. на Wayback Machine .
  5. ^ GenomeWeb « Рош» сотрудничает с ДНК-электроникой, чтобы помочь перенести платформу 454 на электрохимическое обнаружение . Ноябрь 2010 г.
  6. ^ Purushothaman, S, Toumazou, C, Ou, CP Обнаружение протонов и однонуклеотидного полиморфизма: простое использование ионно-чувствительного полевого транзистора
  7. ^ а б в г д Пенниси, Э (2010). «Полупроводники вдохновляют на новые технологии секвенирования». Наука . 327 (5970): 1190. Bibcode : 2010Sci ... 327.1190P . DOI : 10.1126 / science.327.5970.1190 . PMID  20203024 .
  8. ^ a b c d e f Перкель, Дж., «Установление контакта с четвертым поколением секвенирования». Архивировано 27 декабря 2013 г. в Wayback Machine . Биотехники, 2011.
  9. ^ Альбертс Б. Молекулярная биология клетки . 5-е изд. 2008, Нью-Йорк: Наука о гирляндах.
  10. ^ a b Karow, J. (2009) Патентное приложение Ion Torrent предлагает технологию секвенирования с использованием чувствительных к химическим веществам полевых транзисторов . В последовательности.
  11. ^ a b c d e f Bio-IT World, Дэвис, К. Это «Ватсон встречается с Муром», поскольку Ion Torrent представляет Semiconductor Sequencing . Bio-IT World 2010.
  12. ^ a b c d Karow, J. (2009) В AGBT клиенты Ion Torrent предоставляют первую обратную связь; Life Tech описывает рост платформы . В последовательности.
  13. ^ [1]
  14. ^ Ид, Дж. И др., «Секвенирование ДНК в реальном времени из отдельных молекул полимеразы» . Science, 2009. 323 (5910): с. 133-8.
  15. ^ a b Karow, J. (2010) Ion Torrent Systems представляет электронный секвенсор стоимостью 50 000 долларов на AGBT . В последовательности.
  16. ^ Метцкер, ML, «Новые технологии в секвенировании ДНК» . Genome Res, 2005. 15 (12): p. 1767-76.
  17. ^ a b Поллак А., Распространение секвенирования ДНК в массы , в New York Times. 2011: Нью-Йорк.
  18. ^ Chiosea, SI; Уильямс, L; Гриффит, СС; Томпсон, ЛД; Вайнреб, я; Bauman, JE; Luvison, A; Рой, S; Seethala, RR; Никифорова, М.Н. (июнь 2015). «Молекулярная характеристика рака апокринного слюнного протока». Американский журнал хирургической патологии . 39 (6): 744–52. DOI : 10,1097 / pas.0000000000000410 . PMID 25723113 . S2CID 34106002 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Веб-страница Ion Torrent
  • Сайт компании DNA Electronics Ltd.
  • Статья в New York Times