Лигазы цепной реакции ( LCR ) представляет собой метод ДНК - амплификации. Лигазная цепная реакция (LCR) - это процесс амплификации, который отличается от ПЦР тем, что в нем используется термостабильная лигаза для соединения двух зондов или других молекул вместе, которые затем могут быть амплифицированы стандартным циклом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Barany, 1991). Каждый цикл приводит к удвоению молекулы целевой нуклеиновой кислоты. Ключевым преимуществом LCR является большая специфичность по сравнению с ПЦР. [1] Таким образом, для правильной работы LCR требуются два совершенно разных фермента: лигаза , соединяющая молекулы зонда, и термостабильная полимераза (например, Taqполимераза) для амплификации тех молекул, которые участвуют в успешном лигировании. Зонды, участвующие в лигировании, сконструированы таким образом, что 5'-конец одного зонда непосредственно примыкает к 3'-концу другого зонда, тем самым обеспечивая необходимые субстраты групп 3'-OH и 5'-PO4 для лигазы.
LCR был первоначально разработан для обнаружения точечных мутаций; единственное несоответствие оснований на стыке двух молекул зонда - это все, что необходимо для предотвращения лигирования. При выполнении лигирования прямо на Tm олигонуклеотидного зонда допускаются только идеально согласованные дуплексы праймер: матрица. LCR также можно использовать для амплификации молекул-матриц, которые были успешно лигированы, с целью оценки эффективности лигирования и получения большого количества продукта с даже большей специфичностью, чем ПЦР. Таким образом, LCR не обязательно является альтернативой, а скорее дополнением к ПЦР.
Целевые условия
Он широко используется для обнаружения мутаций единичных оснований , например, при генетических заболеваниях . [2]
LCR и ПЦР могут использоваться для обнаружения гонореи и хламидиоза и могут проводиться на образцах мочи первого сбора, обеспечивая легкий сбор и большой выход микроорганизмов. Эндогенные ингибиторы ограничивают чувствительность , но если бы этот эффект можно было устранить, LCR и ПЦР имели бы клинические преимущества перед любыми другими методами диагностики гонореи и хламидиоза. [3] Среди этих методов LCR становится наиболее чувствительным методом с высокой специфичностью для обнаружения известного однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (20). LCR был впервые разработан Барани, который использовал термостабильную ДНК-лигазу для различения нормальной и мутантной ДНК и для амплификации аллель-специфичного продукта. Несоответствие на 3'-конце различающего праймера не позволяет ДНК-лигазе соединить два фрагмента вместе. При использовании обеих цепей геномной ДНК в качестве мишеней для гибридизации олигонуклеотидов продукты, полученные из двух наборов соседних олигонуклеотидных праймеров, комплементарных каждой цепи-мишени в одном раунде лигирования, могут стать мишенями для следующего раунда. Таким образом, количество продуктов может быть увеличено в геометрической прогрессии за счет повторного термоциклирования.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ Видманн, М; Wilson, WJ; Чайка, Дж; Луо, Дж; Барани, Ф; Батт, Калифорния (февраль 1994 г.). «Лигазная цепная реакция (LCR) - обзор и применение» . Методы и приложения ПЦР . 3 (4): S51–64. DOI : 10,1101 / gr.3.4.s51 . PMID 8173509 .
- ^ Барани, Ф (январь 1991 г.). «Обнаружение генетических заболеваний и амплификация ДНК с использованием клонированной термостабильной лигазы» . Proc Natl Acad Sci USA . 88 (1): 189–93. DOI : 10.1073 / pnas.88.1.189 . PMC 50775 . PMID 1986365 .
- ^ Грегори, Дж. Слесарь, доктор медицины. «Новые диагностические тесты на гонорею и хламидиоз». Обновление первичной медико-санитарной помощи для акушеров-гинекологов . 4 : 161–167. DOI : 10.1016 / S1068-607X (97) 00044-9 .
Общее чтение
- Уокер, Дж. М., и Рэпли, Р. (2005). Справочник по медицинским биометодам. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. ISBN 978-1-59259-870-0