Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Буфера для лизиса является буферным раствором , используемым с целью разрушения открытых ячеек для использования в молекулярной биологии экспериментах , которые анализируют лабильные макромолекул из клеток (например , вестерн - блота для белка, или для экстракции ДНК ). Большинство лизиса буфера содержат буферные соли (например , Трисы-HCl ) и ионные соли (например , NaCl ) , чтобы регулировать рН и осмолярность из лизата . Иногда моющие средства (такие как Triton X-100 или SDS ) добавляют для разрушения мембранных структур. Для буферов лизиса, нацеленных наэкстракция белка , ингибиторы протеаз часто включаются, а в сложных случаях могут почти потребоваться. Буферы для лизиса можно использовать как для клеток тканей животных, так и для растений. [1]

Выбор буфера [ править ]

Первичная цель буфера для лизиса - изолировать интересующие молекулы и поддерживать их в стабильной среде. Для белков в некоторых экспериментах целевые белки должны быть полностью денатурированы , в то время как в некоторых других экспериментах целевой белок должен оставаться свернутым и функциональным. Различные белки также имеют разные свойства и находятся в разных клеточных средах. Таким образом, важно выбрать лучший буфер в зависимости от цели и плана экспериментов. Важными факторами, которые следует учитывать, являются: pH, ионная сила, использование детергента, ингибиторов протеазы для предотвращения протеолитических процессов. [2] Например, добавление детергента необходимо при лизировании грамотрицательных бактерий, но не грамположительных бактерий. [3] Обычно в буфер для лизиса добавляют ингибитор протеазы вместе с другими ингибиторами ферментов по выбору, такими как ингибитор фосфатазы, при изучении белков с фосфорилированием.

Компоненты [ править ]

Буфер [ править ]

Буфер создает среду для изолированных белков. Каждый выбор буфера имеет определенный диапазон pH, поэтому буфер следует выбирать в зависимости от того, стабилен ли ваш целевой белок при определенном pH. Кроме того, для буферов с аналогичными диапазонами pH важно учитывать, совместим ли буфер с вашим целевым белком. [4] В таблице ниже указаны несколько наиболее часто используемых буферов и их диапазоны pH. [4]

БуферДиапазон pH
Дигидрофосфат натрия / гидрофосфат натрия5,8 - 8,0
Трис - HCl7,0 - 9,0
HEPES - NaOH7,2 - 8,2

Добавки [ править ]

Соли [ править ]

Буфер для лизиса обычно содержит одну или несколько солей. Функция солей в буфере для лизиса заключается в установлении ионной силы в буферном растворе. Некоторые из наиболее часто используемых солей - это NaCl, KCl и (NH 4 ) 2 SO 4. Они обычно используются с концентрацией от 50 до 150 мМ. [4]

Структура додецилсульфата натрия (SDS)

Моющее средство [ править ]

Состав Triton X-100

Моющие средства представляют собой органические амфипатические (с гидрофобным хвостом и гидрофильной головкой) поверхностно-активные вещества. Они используются для отделения мембранных белков от мембраны, поскольку гидрофобная часть детергента может окружать биологические мембраны и, таким образом, изолировать мембранные белки от мембран. [5] Хотя моющие средства широко используются и имеют схожие функции, важно понимать физические и химические свойства интересующих моющих средств, чтобы определить оптимальное для использования в вашем эксперименте.

Моющие средства часто классифицируются как неионные, анионные, катионные или цвиттерионные, в зависимости от их гидрофильных свойств головной группы. [5]

Неионные детергенты, такие как Triton X-100, и цвиттерионные детергенты, такие как CHAPS (3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат), не денатурируют (не нарушают функции белков). Ионные детергенты, такие как додецилсульфат натрия (SDS), и катионные детергенты, такие как бромид этилтриметиламмония, денатурируют (нарушают функции белка). [6] Детергенты являются основным ингредиентом, который определяет силу лизиса данного буфера для лизиса.

Другое [ править ]

Другие добавки включают ионы металлов, сахар, подобный глюкозе, глицерин, хелаторы металлов (например, EDTA ) и восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол (DTT). [4]

Обычно используемые буферы [ править ]

Буфер для лизиса NP-40 [ править ]

Это может быть наиболее широко используемый буфер для лизиса. Солюбилизирующий агент - NP-40 , который можно заменить другими детергентами в различных концентрациях. Поскольку NP-40 является неионным детергентом, этот буфер для лизиса имеет более мягкий эффект, чем буфер RIPA. Его можно использовать, когда функции белка необходимо сохранить с минимальным нарушением. [7]

Рецепт: [7]

  • 150 мМ NaCl
  • 1,0% Nonidet P-40 или Triton X-100
  • 50 мМ Трис-Cl
  • Отрегулируйте pH до 7,4

Буфер для лизиса RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) [ править ]

Буфер RIPA - это обычно используемый буфер для лизиса для иммунопреципитации и общей экстракции белка из клеток и тканей. Буфер можно хранить без ванадата при 4 ° C до 1 года. [8] Буфер RIPA высвобождает белки из клеток, а также нарушает самые слабые взаимодействия между белками. [7]

Рецепт: [8]

  • 1% (мас.) Nonidet P-40 (NP-40)
  • 1% (мас. / Об.) Дезоксихолат натрия
  • 0,1% (мас. / Об.) SDS
  • 0,15 М NaCl
  • 0,01 М фосфат натрия, pH 7,2
  • 2 мМ ЭДТА
  • 50 мМ фторид натрия (NaF)
  • 0,2 мМ свежий ортованадат натрия (Na 3 VO 4 · 2H 2 O, он обладает функцией ингибитора фосфатазы, поскольку имитирует фосфат)
  • 100 Ед / мл ингибитор протеазы, например апротинин

Буфер для лизиса SDS (додецилсульфат натрия) [ править ]

SDS - ионный денатурирующий детергент. Горячий буфер SDS часто используется, когда белки необходимо полностью солюбилизировать и денатурировать.

Рецепт: [8]

  • 0,5% (мас. / Об.) SDS
  • 0,05 М трис⋅Cl
  • Отрегулируйте pH до 8,0
  • Добавить 1 мМ свежего дитиотреитола (ДТТ)

Лизирующий буфер ACK (хлорид аммония-калий) [ править ]

ACK используется для лизиса эритроцитов в биологических образцах, где другие клетки, такие как белые кровяные тельца, представляют больший интерес. [9]

Рецепт: [10] [11]

  • 150 мМ хлорид аммония
  • 10 мМ бикарбонат калия
  • 0,1 мМ ЭДТА
  • Отрегулируйте pH до 7,2-7,4.

Буфер для лизиса в исследованиях ДНК и РНК [ править ]

В таких исследованиях, как снятие отпечатков пальцев ДНК, буфер для лизиса используется для выделения ДНК. Мыло для посуды можно использовать в крайнем случае, чтобы разрушить клеточные и ядерные мембраны, что позволит высвободить ДНК. Другие такие буферы для лизиса включают запатентованный продукт Qiagen Buffer P2.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Пош, Антон (2014-12-01). «Рекомендации по подготовке проб для двумерного электрофореза». Архив физиологии и биохимии . 120 (5): 192–197. DOI : 10.3109 / 13813455.2014.955031 . ISSN  1744-4160 . PMID  25211021 .
  2. ^ Персик, Мэнди; Марш, Ноэль; Miskiewicz, EwaI .; Макфи, ДэниелДж. (01.01.2015). Куриен, Биджи Т .; Скофилд, Р. Хэл (ред.). Солюбилизация белков: важность выбора буфера для лизиса . Методы молекулярной биологии. 1312 . Springer Нью-Йорк. С. 49–60. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-2694-7_8 . ISBN 9781493926930. PMID  26043989 .
  3. ^ Пош, Антон (2008). 2D-СТРАНИЦА: подготовка проб и фракционирование . Humana Press. С.  24 . ISBN 978-1-58829-722-8.
  4. ^ a b c d Делами, EMBL - Управление информации и общественности. «Очистка белков - Экстракция и осветление - Выбор лизисного буфера и добавок - EMBL» . www.embl.de . Проверено 16 марта 2016 .
  5. ^ a b Линке, Дирк (01.01.2009). Дойчер, Ричард Р. Берджесс и Мюррей П. (ред.). Глава 34 Моющие средства: обзор . Методы в энзимологии . Руководство по очистке белков, 2-е издание. 463 . С. 603–617. DOI : 10.1016 / s0076-6879 (09) 63034-2 . ISBN 9780123745361. PMID  19892194 .
  6. ^ «Детергенты для лизиса клеток и экстракции белков» . www.thermofisher.com . Проверено 16 марта 2016 .
  7. ^ a b c Джи, Хун (01.08.2010). «Лизис культивируемых клеток для иммунопреципитации» . Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2010 (8): pdb.prot5466. DOI : 10,1101 / pdb.prot5466 . ISSN 1940-3402 . PMID 20679375 .  
  8. ^ a b c Сефтон, Бартоломью М. (01.01.2001). «Мечение культивируемых клеток с помощью 32Pi и подготовка клеточных лизатов для иммунопреципитации». Мечение культивируемых клеток 32Pi и подготовка клеточных лизатов для иммунопреципитации . Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 18. John Wiley & Sons, Inc., стр. 18.2. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb1802s40 . ISBN 9780471142720. PMID  18265167 .
  9. ^ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201
  10. ^ "Буфер для лизиса ACK" . Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2014 (11): pdb.rec083295. 2014. DOI : 10.1101 / pdb.rec083295 .
  11. ^ «A10492 - ACK Lysing Buffer - US» .