Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Для получения информации о различных методах см. Методы с использованием нуклеиновых кислот .

Первое выделение ДНК было сделано в 1869 году Фридрихом Мишером . [1] В настоящее время это обычная процедура в молекулярной биологии или судебно-медицинской экспертизе . Для химического метода существует множество различных наборов, используемых для экстракции, и выбор правильного из них сэкономит время на оптимизации набора и процедурах экстракции. Считается, что определение чувствительности ПЦР показывает различия между коммерческими наборами. [2]

История [ править ]

Основная процедура [ править ]

  • Клетки, которые необходимо изучить, необходимо собрать.
  • Разрыв клеточных мембран, чтобы обнажить ДНК вместе с цитоплазмой внутри ( лизис клеток ).
  • Раствор обрабатывают концентрированным солевым раствором (физиологический раствор), чтобы собрать вместе такие остатки, как разрушенные белки, липиды и РНК.
  • Центрифугирование раствора, который отделяет слипшиеся клеточные остатки от ДНК.
  • Очистка ДНК от детергентов, белков, солей и реагентов, используемых на этапе лизиса клеток. Наиболее часто используемые процедуры:
    • Осаждение этанолом обычно ледяным этанолом или изопропанолом . Поскольку ДНК нерастворима в этих спиртах, она будет агрегировать вместе, образуя осадок при центрифугировании . Осаждение ДНК улучшается за счет увеличения ионной силы, обычно путем добавления ацетата натрия .
    • Фенол-хлороформная экстракция, при которой фенол денатурирует белки в образце. После центрифугирования образца денатурированные белки остаются в органической фазе, в то время как водная фаза, содержащая нуклеиновую кислоту , смешивается с хлороформом для удаления остатков фенола из раствора.
    • Очистка в мини-колонке , основанная на том факте, что нуклеиновые кислоты могут связываться ( адсорбция ) с твердой фазой (диоксидом кремния или другой) в зависимости от pH и концентрации соли в буфере.

Клеточные и гистоновые белки, связанные с ДНК, можно удалить либо добавлением протеазы, либо осаждением белков ацетатом натрия или аммония , либо их экстракцией смесью фенол-хлороформ перед осаждением ДНК.

После выделения ДНК растворяют в слабощелочном буфере, обычно в буфере ТЕ или в сверхчистой воде .

Выбор метода [ править ]

Некоторые из наиболее распространенных методов экстракции ДНК включают органическую экстракцию , экстракцию Chelex и твердофазную экстракцию . [3] Эти методы неизменно дают изолированную ДНК, но они различаются как по качеству, так и по количеству полученной ДНК. При выборе метода выделения ДНК необходимо учитывать множество факторов, включая стоимость, время, безопасность и риск заражения.

Органическая экстракция включает добавление и инкубацию в нескольких различных химических растворах; [3], включая стадию лизиса , экстракцию фенолом хлороформом, осаждение этанолом и стадии промывки. Органическая экстракция часто используется в лабораториях, потому что она дешевая и дает большие количества чистой ДНК. Хотя это несложно, здесь много шагов, и это занимает больше времени, чем другие методы. Это также связано с неблагоприятным использованием токсичных химикатов фенола и хлороформа , и существует повышенный риск заражения из-за переноса ДНК между несколькими пробирками. [4]Несколько протоколов, основанных на органической экстракции ДНК, были эффективно разработаны десятилетия назад [5], хотя в последние годы также были разработаны и опубликованы улучшенные и более практичные версии этих протоколов. [6]

Метод экстракции Chelex включает добавление смолы Chelex к образцу, кипячение раствора, затем его встряхивание и центрифугирование. Клеточные материалы связываются с гранулами Chelex, а ДНК находится в супернатанте . [4] Метод Chelex намного быстрее и проще, чем органическая экстракция, и для него требуется только одна пробирка, что снижает риск загрязнения ДНК. К сожалению, экстракция Chelex не дает такого большого количества, и полученная ДНК является одноцепочечной, что означает, что ее можно использовать только для анализов на основе ПЦР, но не для ПДРФ . [4]

Твердофазная экстракция, такая как использование метода экстракции на спин-колонке, использует тот факт, что ДНК связывается с диоксидом кремния . Образец, содержащий ДНК, добавляют в колонку, содержащую силикагель или гранулы диоксида кремния и хаотропные соли. Хаотропные соли нарушают водородную связь между цепями и способствуют связыванию ДНК с диоксидом кремния, заставляя нуклеиновые кислоты становиться гидрофобными. Таким образом, остатки фосфата становятся доступными для адсорбции. [7] ДНК связывается с диоксидом кремния, а остальная часть раствора вымывается этанолом для удаления хаотропных солей и других ненужных компонентов. [3]Затем ДНК можно регидратировать водными растворами с низким содержанием солей, что позволяет элюировать ДНК из гранул.

Этот метод дает высококачественную, в основном, двухцепочечную ДНК, которую можно использовать как для ПЦР, так и для ПДРФ- анализа. Эта процедура может быть автоматизирована [4] и имеет высокую производительность, хотя и более низкую, чем метод фенол-хлороформ . Это одностадийный метод, т.е. вся процедура выполняется в одной пробирке. Это снижает риск заражения, что делает его очень полезным для судебного извлечения ДНК. Коммерческие наборы для множественной твердофазной экстракции производятся и продаются разными компаниями; единственная проблема в том, что они дороже, чем органическая экстракция или экстракция Chelex.

Особые типы [ править ]

Для выделения ДНК из некоторых образцов необходимо выбрать конкретные методы. Типичные образцы со сложным выделением ДНК:

  • археологические образцы, содержащие частично деградированную ДНК, см. древнюю ДНК [8]
  • образцы, содержащие ингибиторы последующих процедур анализа, в первую очередь ингибиторы ПЦР , такие как гуминовая кислота из почвы, индиго и другие красители для тканей или гемоглобин в крови
  • образцы микроорганизмов с толстой клеточной стенкой, например дрожжей
  • образцы, содержащие смешанную ДНК из нескольких источников

Экстрахромосомную ДНК, как правило, легко выделить, особенно плазмиды можно легко выделить путем лизиса клеток с последующим осаждением белков, что улавливает хромосомную ДНК в нерастворимой фракции, а после центрифугирования плазмидную ДНК можно очистить от растворимой фракции.

Экстракция ДНК Hirt - это выделение всей внехромосомной ДНК в клетке млекопитающего. Процесс экстракции Hirt избавляет от высокомолекулярной ядерной ДНК , оставляя только низкомолекулярную митохондриальную ДНК и любые вирусные эписомы, присутствующие в клетке.

Обнаружение ДНК [ править ]

Основная статья: Количественное определение нуклеиновых кислот

Индикатор дифениламина (DPA) подтвердит присутствие ДНК. Эта процедура включает химический гидролиз ДНК: при нагревании (например, ≥95 ° C) в кислоте реакция требует сахара дезоксирибозы и, следовательно, специфична для ДНК. В этих условиях 2-дезоксирибоза превращается в w-гидроксилевулиниловый альдегид, который реагирует с соединением, дифениламином, с образованием соединения синего цвета. Концентрация ДНК может быть определена путем измерения интенсивности поглощения раствора при длине волны 600 нм с помощью спектрофотометра и сравнения со стандартной кривой известных концентраций ДНК.

Измерение интенсивности поглощения раствора ДНК при длинах волн 260 и 280 нм используется в качестве меры чистоты ДНК. ДНК поглощает УФ- свет с длиной волны 260 и 280 нм, а ароматические белки поглощают УФ-свет с длиной волны 280 нм; чистый образец ДНК имеет соотношение 1,8 при 260/280 и относительно свободен от белкового загрязнения. Препарат ДНК, загрязненный белком, будет иметь соотношение 260/280 ниже 1,8.

ДНК можно определить количественно, разрезав ДНК рестрикционным ферментом , пропустив ее на агарозном геле , окрашивая бромидом этидия (EtBr) или другим красителем и сравнивая интенсивность ДНК с маркером ДНК известной концентрации.

Используя метод Саузерн-блоттинга , эту количественно определенную ДНК можно выделить и исследовать далее с помощью ПЦР и ПДРФ- анализа. Эти процедуры позволяют дифференцировать повторяющиеся последовательности в геноме. Именно эти методы используют криминалисты для сравнения, идентификации и анализа.

Метод выделения высокомолекулярной ДНК [ править ]

В этом методе ядра растений выделяются путем физического измельчения тканей и восстановления неповрежденных ядер в уникальном буфере для ядерной изоляции (NIB). Пластидные ДНК высвобождаются из органелл и удаляются осмотическим буфером путем промывки и центрифугирования. Затем очищенные ядра лизируют и дополнительно очищают путем органической экстракции, а геномную ДНК осаждают с помощью высокой концентрации CTAB. Высокочистая высокомолекулярная гДНК извлекается из ядер, растворяется в буфере с высоким pH, что обеспечивает стабильное долгосрочное хранение. [9]

См. Также [ править ]

  • Стреловой метод
  • Дактилоскопия ДНК
  • Секвенирование ДНК
  • Структура ДНК
  • Осаждение этанолом
  • Плазмидный препарат
  • Полимеразной цепной реакции
  • Очистка ДНК SCODA

Ссылки [ править ]

  1. ^ Dahm R (январь 2008). «Открытие ДНК: Фридрих Мишер и первые годы исследований нуклеиновых кислот». Генетика человека . 122 (6): 565–81. DOI : 10.1007 / s00439-007-0433-0 . PMID  17901982 .
  2. ^ Ёшикава H, Dogruman-Al F, Dogruman-Ai F, Turk S, S Kustimur, Балабан N, N Sultan (октябрь 2011). «Оценка наборов для выделения ДНК для молекулярной диагностики подтипов человека Blastocystis из образцов кала». Паразитологические исследования . 109 (4): 1045–50. DOI : 10.1007 / s00436-011-2342-3 . PMID 21499752 . 
  3. ^ а б в Элкинс К.М. (2013). «Извлечение ДНК». Судебная ДНК-биология . С. 39–52. DOI : 10.1016 / B978-0-12-394585-3.00004-3 . ISBN 9780123945853.
  4. ^ а б в г Батлер Дж. М. (2005). Судебное типирование ДНК: биология, технология и генетика STR-маркеров (2-е изд.). Амстердам: Elsevier Academic Press. ISBN 9780080470610. OCLC  123448124 .
  5. ^ Мармур, Дж. (1961). «Процедура выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов». Журнал молекулярной биологии . 3 (2): 208 – IN1. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (61) 80047-8 .
  6. ^ Сэльва-Серра F, Свенсон-Штадлер л, Бускетс А, Хаэн-Luchoro D, Karlsson R, Мур Е.Р., Гомила М (2018). «Протокол экстракции и очистки высококачественной и количественной бактериальной ДНК, применимый для секвенирования генома: модифицированная версия процедуры Мармура» . Обмен протоколами . DOI : 10.1038 / protex.2018.084 .
  7. Рианна Ли, Ричард (11 марта 2015 г.). Судебная биология (2-е изд.). Бока-Ратон. ISBN 978-1439889725. OCLC  907517669 .
  8. ^ Pääbo S (март 1989). «Древняя ДНК: выделение, характеристика, молекулярное клонирование и ферментативная амплификация» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 86 (6): 1939–43. Bibcode : 1989PNAS ... 86.1939P . DOI : 10.1073 / pnas.86.6.1939 . PMC 286820 . PMID 2928314 .  
  9. ^ Ли, Чжиган; Пэррис, Стивен; Саски, Кристофер А. (2020). «Простой метод экстракции высокомолекулярной ДНК из растений, подходящий для одномолекулярных технологий» . Растительные методы . 16 : 38. DOI : 10,1186 / s13007-020-00579-4 . ISSN 1746-4811 .  Текст был скопирован из этого источника, доступного по международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 .

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Сэмбрук, Майкл Р. Грин, Джозеф. Молекулярное клонирование . (4-е изд. Изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор Пр. ISBN 1936113422 . 
  • Судебная биология, Ричард Ли, (2015) Бока-Ратон: CRC Press, Taylor & Francis Group. ISBN 9781439889701 

Внешние ссылки [ править ]

  • Как извлечь ДНК из всего живого
  • Виртуальная лаборатория экстракции ДНК