Осаждение этанолом - это метод, используемый для очистки и / или концентрирования РНК , ДНК и полисахаридов, таких как пектин и ксилоглюкан, из водных растворов путем добавления этанола в качестве антирастворителя.
Осаждение ДНК
Теория
ДНК полярна из-за ее высоко заряженного фосфатного остова. Его полярность делает его водорастворимым (вода полярна) по принципу «подобное растворяется в подобном» .
Из-за высокой полярности воды, что подтверждается ее высокой диэлектрической проницаемостью 80,1 (при 20 ° C), электростатические силы между заряженными частицами в водном растворе значительно ниже, чем в вакууме или в воздухе.
Это соотношение отражено в законе Кулона , который можно использовать для расчета силы, действующей на два заряда а также разделены расстоянием используя диэлектрическую проницаемость (также называемая относительной статической диэлектрической проницаемостью) среды в знаменателе уравнения (это электрическая постоянная ):
На атомном уровне уменьшение силы, действующей на заряд, происходит из-за того, что молекулы воды образуют вокруг него гидратную оболочку . Этот факт делает воду очень хорошим растворителем для заряженных соединений, таких как соли. Электрическая сила, которая обычно удерживает кристаллы соли вместе посредством ионных связей , ослабляется в присутствии воды, позволяя ионам отделяться от кристалла и распространяться по раствору.
Тот же механизм действует в случае отрицательно заряженных фосфатных групп на основной цепи ДНК: даже если в растворе присутствуют положительные ионы, относительно слабая суммарная электростатическая сила не позволяет им образовывать стабильные ионные связи с фосфатами и выпадать в осадок из раствора.
Этанол гораздо менее полярен, чем вода, с диэлектрической проницаемостью 24,3 (при 25 ° C). Это означает, что добавление этанола к раствору нарушает экранирование зарядов водой. Если добавлено достаточное количество этанола, электрическое притяжение между фосфатными группами и любыми положительными ионами, присутствующими в растворе, становится достаточно сильным для образования стабильных ионных связей и осаждения ДНК. Обычно это происходит, когда этанол составляет более 64% раствора. Согласно механизму, раствор должен содержать положительные ионы, чтобы произошло осаждение; обычно эту роль играет Na + , NH 4 + или Li + . [1]
Упражняться
ДНК преципитируют, сначала убедившись, что в растворе присутствует правильная концентрация положительных ионов (слишком много приведет к соосаждению большого количества соли с ДНК, слишком мало приведет к неполному восстановлению ДНК), а затем добавив от двух до трех объемов не менее 95% этанола. Многие протоколы рекомендуют хранить ДНК при низкой температуре в этот момент, но есть также наблюдения, что это не может улучшить восстановление ДНК и может даже снизить эффективность осаждения при использовании времени инкубации в течение ночи. [2] [3] Таким образом, хорошая эффективность может быть достигнута при комнатной температуре, но если принять во внимание возможную деградацию, вероятно, лучше инкубировать ДНК на влажном льду. Оптимальное время инкубации зависит от длины и концентрации ДНК. Меньшие фрагменты и более низкие концентрации потребуют более длительного времени для достижения приемлемого извлечения. Для очень малых размеров и низких концентраций рекомендуется инкубация в течение ночи. В таких случаях использование таких носителей, как тРНК , гликоген или линейный полиакриламид, может значительно улучшить восстановление.
Во время инкубации ДНК и некоторые соли будут выпадать в осадок из раствора, на следующем этапе этот осадок собирают центрифугированием в микроцентрифужной пробирке на высоких скоростях (~ 12000 g ). Время и скорость центрифугирования имеют наибольшее влияние на скорость восстановления ДНК. Опять же, более мелкие фрагменты и более высокие разведения требуют более длительного и быстрого центрифугирования. Центрифугирование можно проводить либо при комнатной температуре, либо при 4 ° C или 0 ° C. Во время центрифугирования осажденная ДНК должна пройти через раствор этанола на дно пробирки, более низкие температуры увеличивают вязкость раствора, а большие объемы увеличивают расстояние, поэтому оба эти фактора снижают эффективность этого процесса, требующего более длительного центрифугирования для того же эффекта. [2] [3] После центрифугирования надосадочный раствор удаляют, оставляя осадок неочищенной ДНК. Виден ли осадок, зависит от количества ДНК и от ее чистоты (более грязные гранулы легче увидеть) или от использования соосадителей.
На следующем этапе к осадку добавляется 70% этанол, и он осторожно перемешивается, чтобы отделить гранулу и промыть ее. Это удаляет часть солей, присутствующих в оставшемся супернатанте и связанных с осадком ДНК, делая окончательную более чистую ДНК. Эту суспензию снова центрифугируют для повторного осаждения ДНК и удаляют надосадочный раствор. Этот шаг повторяется один раз.
Наконец, осадок сушат на воздухе и ресуспендируют ДНК в воде или другом желаемом буфере . Важно не пересушивать осадок, так как это может привести к денатурации ДНК и затруднить ресуспендирование.
Изопропанол также можно использовать вместо этанола; эффективность осаждения изопропанола выше, поэтому одного объема достаточно для осаждения. Однако изопропанол менее летуч, чем этанол, и для его высыхания на заключительном этапе требуется больше времени. Гранула также может менее плотно прилипать к трубке при использовании изопропанола. [1]
Смотрите также
Рекомендации
- ^ a b Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (третье издание) Джозефа Сэмбрука , Институт рака Питера МакКаллума , Мельбурн, Австралия; Дэвид Рассел, Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас
- ^ a b Zeugin JA, Hartley JL (1985). «Осаждение ДНК этанолом» (PDF) . Сосредоточьтесь . 7 (4): 1-2 . Проверено 10 сентября 2008 .
- ^ а б Crouse J, Amorese D (1987). «Осаждение этанолом: ацетат аммония как альтернатива ацетату натрия» (PDF) . Сосредоточьтесь . 9 (2): 3–5. Архивировано из оригинального (PDF) 22 ноября 2009 года . Проверено 10 сентября 2008 .
Внешние ссылки
- bitesizebio.com Основы: как работает осаждение этанолом ДНК и РНК
- Зейгин Дж. А., Хартли Дж. Л. (1985). «Осаждение ДНК этанолом» (PDF) . Сосредоточьтесь . 7 (4): 1-2 . Проверено 10 сентября 2008 .
- Crouse J, Amorese D (1987). «Осаждение этанолом: ацетат аммония как альтернатива ацетату натрия» (PDF) . Сосредоточьтесь . 9 (2): 3–5. Архивировано из оригинального (PDF) 22 ноября 2009 года . Проверено 10 сентября 2008 .