Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Не путать с молекулярным маркером , который является генетическим маркером .

Маркер размера молекулярной массы в виде лестницы ДНК размером 1 т.п.н. в самой правой полосе, используемый в гель-электрофорезе. Условия геля: 1% агароза, 3 вольт / см и окраска бромистым этидием.

Размер маркера молекулярной массы , также упоминается как белка лестница , ДНК лестница или РНК лестница , представляет собой набор стандартов , которые используются для определения приблизительной размер молекулы перспективы на гель во время электрофореза , используя принцип , что молекулярный Вес обратно пропорционален скорости миграции через гелевую матрицу. Следовательно, при использовании в гель-электрофорезе маркеры эффективно обеспечивают логарифмическую шкалу. для оценки размера других фрагментов (при условии, что размеры фрагментов маркера известны).

Белковые, ДНК и РНК-маркеры с заранее определенными размерами фрагментов и концентрациями коммерчески доступны. Их можно запускать как в агарозном, так и в полиакриламидном гелях . Маркеры загружаются в дорожки, прилегающие к дорожкам для отбора проб, до начала прогона.

Маркеры ДНК [ править ]

Электрофорезный гель с лестницами ДНК различной длины в левой и средней полосах. Размеры фрагментов указаны справа в парах оснований .

Развитие [ править ]

Хотя концепция маркеров молекулярной массы сохранилась, методы разработки менялись на протяжении многих лет. Новые изобретения маркеров молекулярной массы распространяются в наборах, соответствующих типу маркера.

Первой проблемой при разработке маркеров было достижение высокого разрешения по всей длине маркера. [1] В зависимости от условий проведения гель-электрофореза фрагменты могли быть сжаты, что нарушало четкость изображения. Для решения этой проблемы в 1990 году был разработан набор для Саузерн-блоттинга , который стал первым маркером, объединяющим ДНК-мишень и ДНК зонда. В этом методе использовалось преимущество логарифмического интервала, и его можно было использовать для идентификации целевых полос длиной более 20 000 нуклеотидов . [2]

Дизайн [ править ]

Существует два распространенных метода конструирования маркера размера молекулярной массы ДНК. [3] Один из таких методов использует технику частичного лигирования . [3] ДНК-лигирование - это процесс, с помощью которого линейные части ДНК соединяются друг с другом ковалентными связями ; более конкретно, эти связи представляют собой фосфодиэфирные связи . [4] Здесь фрагмент дуплексной ДНК размером 100 п.н. частично лигирован. Следствием этого является то, что образуются димеры размером 200 пар оснований, тримеры 300 пар оснований, тетрамеры размером 400 пар оснований, пентамеры размером 500 пар оснований и т.д. Кроме того, останется часть дцДНК размером 100 п.н. В результате на геле создается «лестница» ДНК, состоящая из кусочков ДНК известной молекулярной массы . [3]

Второй метод использует рестрикционные ферменты и узнаваемую последовательность ДНК. [3] ДНК переваривается определенным рестрикционным ферментом, в результате чего образуются фрагменты ДНК различной молекулярной массы. Одним из преимуществ этого метода является то, что можно легко создать больше маркеров, просто переварив больше известной ДНК. [3] С другой стороны, размер фрагментов ДНК зависит от участков, где рестрикционный фермент разрезает. Это затрудняет контроль размера фрагментов в маркере. [5]

В последнее время в лабораториях используется другой метод конструирования маркеров размера молекулярной массы ДНК. Эта стратегия включает использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) . [5] Это достигается одним или двумя способами: 1) ДНК-мишень амплифицируется одновременно с помощью наборов праймеров , или 2) различные ДНК-мишени амплифицируются независимо с помощью определенных праймеров. [5]

Влияние условий геля [ править ]

Как и в случае с экспериментальными образцами, состояние геля может влиять на маркер размера молекулярной массы, который проходит рядом с ними. Такие факторы, как буфер , заряд / напряжение и концентрация геля, могут повлиять на подвижность и / или внешний вид вашего маркера / лестницы / стандарта. Эти элементы необходимо учитывать при выборе маркера и при анализе окончательных результатов на геле.

1,2% агарозный гель, показывающий две разные лестницы ДНК, окрашенные красителем GelRed
Буферы
Буферы действуют для 1) установления pH и 2) обеспечения ионами для поддержания проводимости. В электрофореза ДНК , то ТАЕ (Трис-ацетат-ЭДТА) и КЭ (Трис-борат-ЭДТА) являются обычные буферы выбора. [6] Буфер TBE предпочтителен для небольших фрагментов ДНК, тогда как TAE лучше подходит для фрагментов, превышающих 1500 пар оснований. Что касается емкости буферизации, TAE ниже по сравнению с TBE; это обычно приводит к более медленной подвижности ДНК. TBE также имеет лучшее разрешение. [7]
Следует отметить, что вода не может выступать в качестве замены одного из этих буферов, так как ДНК не будет перемещаться по гелю. [6] Кроме того, использование воды вместо буфера приведет к плавлению геля . [8]
Заряд / Напряжение
Что касается напряжения, рекомендуемый диапазон составляет от 4 до 10 В / см (т. Е. Вольт / см). [8] Гели агарозы обычно работают при напряжении 5 В / см. [3] [6] Единица расстояния, см , относится к расстоянию между электродами (т. Е. Анодом и катодом ), а не к длине самого геля. [3] [6]
Напряжения, слишком большие или меньшие, чем этот диапазон, повлияют на подвижность и разрешение полос. Низкое напряжение уменьшит подвижность и вызовет расширение полос. С другой стороны, высокое напряжение уменьшит разрешение полос. Во многом это связано с тем, что слишком высокое напряжение может вызвать перегрев геля и даже его плавление. [8]
Концентрация
При выборе маркера необходимо учитывать концентрацию агарозы. Процент геля влияет на миграцию ДНК. [3] [6] Как правило, чем выше концентрация геля, тем медленнее скорость движения ДНК через гель. Это в дополнение к той роли, которую молекулярная масса играет в миграции маркера ДНК или образца, то есть, чем выше молекулярная масса, тем медленнее будет мигрировать ДНК. [3] [6]
Концентрация геля также влияет на способность визуализировать полосы, выходящие на гель. Меньшие полосы лучше разрешаются на геле с более высоким процентным содержанием, тогда как полосы с увеличенной молекулярной массой легче визуализируются на геле с более низким процентным содержанием. [6]

Белковые маркеры [ править ]

Развитие [ править ]

Раньше белковые маркеры разрабатывались с использованием различных цельных белков. Разработка набора, включающего маркер размера молекулярной массы на основе фрагментов белка, началась в 1993 году. Этот маркер белка, состоящий из 49 различных аминокислотных последовательностей, включал мультидоменные белки и позволял анализировать белки, расщепляемые в разных местах. [9]

Современные технические усовершенствования белковых маркеров включают использование саморазвития. Первый саморазвивающийся белковый маркер с регулярным весом был изобретен в 2012 году [10].

Дизайн [ править ]

Подобно ДНК-маркерам, эти маркеры обычно состоят из очищенных белков, молекулярные массы которых уже известны. [3] В приведенном ниже списке указаны некоторые белки, а также молекулярная масса, которые обычно используются при построении белкового маркера.

Иммуноблот с белковой лестницей в крайней левой полосе. Размеры фрагментов измеряются в кДа ( килодальтон ).
ПротеинМолекулярная масса ( кДа )
Бета-галактозидаза120 [11]
Фосфорилаза B94 [3] [12]
Альбумин бычьей сыворотки (BSA)67 [3] [12]
Овальбумин43 [3]
Альбумин индейки40 [12]
Карбоангидраза30 [3] [12]
Ингибитор трипсина сои20,1 [3] [12]
а-лактальбумин14,4 [3] [12]
Лизоцим14 [13]

Выбор правильного белкового маркера [ править ]

Маркеры размера молекулярной массы можно разделить на две категории: маркеры молекулярной массы и маркеры молекулярной лестницы. [14] Маркеры окрашены или неокрашены, и в зависимости от обстоятельств один может быть более подходящим, чем другой. Маркеры размера молекулярной массы также могут быть изменены биохимически. [15] Конъюгация с биотином является наиболее распространенной. Маркеры размера молекулярной массы наиболее часто используются в электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле и вестерн-блоттинге.. При всех различных типах и использовании маркеров размера молекулярной массы важно выбрать соответствующий стандарт белка. Помимо наиболее распространенного использования в качестве способа расчета молекулярной массы образцов, другие применения включают предоставление визуальных свидетельств миграции и эффективности переноса белка, а иногда даже используются для положительного контроля. [16]

Маркер MW против протеиновых лестниц
Маркер молекулярной массы - это один из типов стандарта белка. Они могут быть предварительно окрашенными или неокрашенными перед загрузкой; в зависимости от типа эксперимента один может быть более выгодным. В любом случае они обычно проходят по внешней дорожке геля, а образец загружается по средним дорожкам. [14] Молекулярные маркеры отличаются от белковых лестниц тем, что они состоят из смеси нативных белков, характеристики которых хорошо классифицированы, но не соответствуют целым числам. [14] Как правило, они намного дешевле, но анализ позволяет получить только приблизительное значение белков, разделенных электрофорезом. [14]
Белковая лестница - это еще один тип стандарта белка. Они почти всегда в пятнах. [14] Белковые лестницы отличаются от молекулярных маркеров тем, что они состоят из смеси высокоочищенных белков, характеристики которых известны и соответствуют целым числам. [14] Обычно белковые лестницы состоят из 10-12 белков. [14] В конце эксперимента, после миграции размера, одна полоса будет представлять размер каждого белка, содержащегося в лестнице. [17] Маркеры расположены равномерно, и анализ размера с использованием этих маркеров позволяет точно определить интересующий белок. В некоторых случаях в качестве метода молекулярного подтверждения MW-маркеры используются с белковыми лестницами для проверки. [14]
Предварительно окрашенные и неокрашенные маркеры
Белковые маркеры могут быть неокрашенными или предварительно окрашенными, но оба имеют свои преимущества и недостатки. [18] Простая визуализация разделения и переноса белков стала возможной благодаря использованию предварительно окрашенных маркеров. [18] Они обычно используются как для электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, так и для вестерн-блоттинга. В SDS-PAGE он позволяет отслеживать миграцию белка, поскольку полосы белка будут разделяться и их можно будет увидеть во время электрофоретического анализа. При вестерн-блоттинге окрашенные стандарты белка позволяют визуализировать перенос белка на мембрану. [17] Однако определение размера с этими маркерами не так точно (см. Раздел «Рекомбинантные и природные маркеры» для дальнейшего объяснения). [18]
Хотя неокрашенные маркеры позволяют более точно определить размер, их нельзя увидеть во время растекания геля. Таким образом, гель необходимо окрасить, чтобы увидеть полосы. [19]
Рекомбинантные и природные маркеры
Помимо окрашенных и неокрашенных маркеров, белковые маркеры можно рассматривать как рекомбинантные и природные. [18] Рекомбинантные маркеры состоят из сильно очищенных рекомбинантных белков. Эти маркеры разработаны таким образом, чтобы выделять определенные характеристики. [18] Примеры этих характеристик включают аффинные метки и молекулярные массы, которые равномерно расположены относительно друг друга. [18]
Природные маркеры, как следует из названия, представляют собой смесь белков, которые встречаются в природе. [18] Предварительно окрашенные натуральные маркеры хорошо подходят для визуализации отделения геля. Однако эти маркеры имеют тенденцию связываться с пятном ковалентным образом в различных количествах и в различных положениях. [18] Следовательно, результирующие полосы могут быть шире. Это особенно верно при сравнении с предварительно окрашенными рекомбинантными маркерами. Из-за этого эффекта определения молекулярной массы, вероятно, будут менее точными с предварительно окрашенными натуральными маркерами. [18]
Биохимически измененный
Стандарты белков также можно изменять химически. Обычное изменение происходит из-за использования биотина . Биотин имеет очень высокое сродство к стрептавидину , и поэтому связывание образует очень прочный комплекс. Для визуализации к стрептавидину прикрепляют цветовую метку. [15]

Влияние условий геля [ править ]

Как и в случае с электрофорезом ДНК, при выборе белкового маркера следует учитывать такие условия, как буферность, заряд / напряжение и концентрация.

Буферы
Буферы могут влиять на подвижность как маркера, так и образцов. PH буфера варьируется в зависимости от используемой системы, и, следовательно, каждая буферная система будет по-разному влиять на заряд белка или белков. [20] Кроме того, в случае SDS-PAGE сродство связывания с SDS может зависеть от системы буферизации. [20] Даже при использовании одного и того же процента и типа геля одни и те же белки будут мигрировать с разной скоростью в зависимости от используемого буфера. [20]
Заряд / Напряжение
Напряжение играет роль в подвижности белков на геле. Белки будут мигрировать быстрее при более высоких напряжениях. Следовательно, время растекания геля будет короче. И наоборот, более высокие напряжения могут привести к большей диффузии полосы. [20] Кроме того, если напряжение слишком высокое, температура в камере для электрофореза может стать такой, что гель начнет плавиться. [20]
Напряжение, при котором должен работать гель, зависит от типа геля. Для некоторых гелей напряжение остается постоянным на протяжении всего цикла, тогда как для других гелей начальное напряжение может оставаться постоянным в течение определенного времени, прежде чем оно будет увеличено. [20] Это второе напряжение затем используется в течение определенного периода времени, после чего оно также может быть увеличено. [20]
Концентрация
В процентном отношении гели, используемые для электрофореза белков, можно разделить на гели с одним процентным соотношением и градиентные гели. [18] Однопроцентные гели также называют линейными гелями. [20] Для линейных гелей выбранный процент обычно составляет от 7,5% до 20%. [18] Общие процентные диапазоны для градиентных гелей составляют 4-15% и 10-20%. У каждого вида геля есть свои преимущества. [18] Например, линейные гели предпочтительны, когда несколько белков имеют одинаковые молекулярные массы; Лучшее разделение между этими белками будет отображаться линейным гелем. [18] С другой стороны, градиентные гели являются лучшим выбором, когда представляющие интерес образцы содержат белки с сильно различающейся молекулярной массой или которые охватывают широкий диапазон молекулярных масс. [18] [20]

Маркеры РНК [ править ]

Полоса подвергнутого электрофорезу агарозного геля, показывающая лестницу РНК с полосами в диапазоне 281-6583 пар оснований

Развитие [ править ]

РНК-лестницы, состоящие из маркеров размера молекулярной массы РНК, были первоначально разработаны с использованием метода синтетических кругов [21] для получения маркеров разного размера. Этот метод был усовершенствован изобретателем Эриком Т. Кулом для использования кольцевых ДНК- векторов в качестве метода получения маркеров размера молекулярной массы РНК. Так называемый метод катящегося круга, усовершенствования этого метода связаны с его эффективностью в синтезе олигонуклеотидов РНК . Из кольцевой ДНК-матрицы можно получить одноцепочечную РНК длиной от 4 до 1500 п.н. без необходимости использования праймеров и путем рециркуляции нуклеотидтрифосфата.. ДНК также можно синтезировать из круглого шаблона, что делает этот метод более универсальным. По сравнению с транскрипцией стока , метод синтетического круга дает олигонуклеотиды РНК без стока. По сравнению с ПЦР метод синтетических кругов позволяет получать олигонуклеотиды РНК без необходимости использования полимеразы или термоциклера . Этот метод также экономически эффективен, поскольку позволяет синтезировать большие количества продукта с меньшим количеством ошибок, чем машинные синтезаторы. [21]

Дизайн [ править ]

Маркеры РНК состоят из транскриптов РНК различной увеличивающейся длины. Например, Lonza 0.5-9 т.п.н. маркер [22] имеет полосы маркировки 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 9 и килобаза пар. Маркеры растворяются в буфере для хранения, таком как EDTA , и могут иметь срок годности до 2 лет при хранении при -80 ° C. Чтобы использовать маркер, например, для Нозерн-блот-анализа, его сначала размораживают , а затем окрашивают, чтобы его можно было обнаружить с помощью гель-электрофореза. Одним из наиболее распространенных красителей, используемых для маркеров, является бромистый этидий .

Диапазон конкретного маркера относится к множеству диапазонов, которые он может отобразить. «Высокий» диапазон относится к относительно большим фрагментам (измеряется в п.о.), тогда как «низкий» диапазон относится к маркерам, которые различают небольшие фрагменты (измеряются в п.о.). Некоторые маркеры можно даже охарактеризовать как «ультранизкий диапазон» [16], но еще более точным является маркер микроРНК. Маркер микроРНК можно использовать для измерения фрагментов РНК в пределах дюжины нуклеотидов, таких как маркер микроРНК 17-25 нуклеотидов. [23]

Используйте [ редактировать ]

При эквивалентной молекулярной массе РНК будет мигрировать быстрее, чем ДНК. Однако и РНК, и ДНК имеют отрицательный линейный наклон между расстоянием миграции и логарифмической молекулярной массой. [24] То есть образцы меньшего веса могут перемещаться на большее расстояние. Это соотношение необходимо учитывать при выборе РНК или ДНК-маркеров в качестве стандарта.

При проведении анализа РНК-маркеров и образцов РНК на геле важно предотвратить загрязнение нуклеазами , поскольку РНК очень чувствительна к деградации рибонуклеазой (РНКазой) в результате катализа . [25] [26] Таким образом, все материалы, которые будут использоваться в процедуре, должны быть приняты во внимание. Любые изделия из стекла , который должен входить в контакт с РНК должны быть предварительно обработано с диэтилпирокарбонатом (DEPC) и пластмассовые материалы должны быть одноразовыми. [25]

Маркеры размера молекулярной массы и SDS-PAGE [ править ]

SDS-PAGE гель с использованием стандарта размера молекулярной массы в левой внешней полосе

Одно из наиболее распространенных применений маркеров размера молекулярной массы - электрофорез в геле. Цель гель-электрофореза состоит в том, чтобы разделить белки по физическим или химическим свойствам , которые включают заряд, размер молекулы и pH . <При разделении по размеру идеальным методом является электрофорез в SDS-PAGE или полиакриламидном геле и маркеры размера молекулярной массы. соответствующие стандарты для использования.

Гели могут различаться по размеру. Подходящий размер геля будет зависеть от количества проб, подлежащих анализу. Все гели разделены на полосы, которые проходят через гель параллельно. Каждая дорожка будет содержать определенный образец. Обычно стандарты размера молекулярной массы размещаются на внешней дорожке. Если гель имеет особенно большое количество полосок, то для большей прозрачности можно разместить несколько лестниц поперек геля.

Белки и стандарты наносят пипеткой на гель в соответствующие дорожки. Додецилсульфат натрия (SDS) взаимодействует с белками, денатурируя их и придавая им отрицательный заряд. Поскольку все белки имеют одинаковое отношение заряда к массе, подвижность белка через гель будет зависеть исключительно от молекулярной массы. Как только электрическое поле будет включено, начнется миграция белка. По завершении можно использовать механизм обнаружения, такой как вестерн-блоттинг, который выявит наличие полос. Каждая полоса представляет определенный белок. Расстояние путешествия зависит исключительно от молекулярной массы; поэтому молекулярная масса каждого белка может быть определена путем сравнения расстояния между неизвестным белком и стандартом известной молекулярной массы.[27]

Различное использование маркеров размера молекулярной массы [ править ]

Существует множество типов маркеров размера молекулярной массы, и каждый из них обладает уникальными характеристиками, что позволяет использовать их в ряде биологических методов. Выбор маркера размера молекулярной массы зависит от типа маркера (ДНК, РНК или белок) и предлагаемого диапазона длин (например, 1 килобайт). Прежде чем выбрать маркер размера молекулярной массы, важно ознакомиться с этими характеристиками и свойствами. В конкретном случае один тип может быть более подходящим, чем другой. Хотя конкретные маркеры могут различаться в разных протоколах для данной техники, в этом разделе будут описаны общие маркеры и их роли.

Аллозимы [ править ]

Первым типом молекулярных маркеров, разработанных и исследованных на гель-электрофорезе, были аллозимы . Эти маркеры используются для обнаружения изменений белка. Слово «аллозим» (также известное как «аллоэнзим») происходит от « аллельных вариантов ферментов ». [28] При работе с гелем белки разделяются по размеру и заряду. Хотя аллозимы могут показаться устаревшими по сравнению с другими доступными маркерами, они все еще используются сегодня, в основном из-за их низкой стоимости. Одним из основных недостатков является то, что, поскольку доступно только ограниченное количество, специфичность является проблемой. [28]

Маркеры на основе ДНК (1960-е) [ править ]

Хотя аллозимы могут обнаруживать вариации в ДНК, это косвенный метод и не очень точный. Маркеры на основе ДНК были разработаны в 1960-х годах. [28] Эти маркеры гораздо более эффективны при различении вариантов ДНК. Сегодня это наиболее часто используемые маркеры. Маркеры на основе ДНК работают, исследуя нуклеотиды, которые могут выполнять множество функций, таких как обнаружение различий в нуклеотидах или даже количественное определение количества мутаций . [28]

RFLP
Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента - это метод, используемый для обнаружения вариаций в гомологичной ДНК. [29] Для переваривания ДНК используются специфические эндонуклеазы рестрикции . Молекулярный маркер RFLP специфичен для одного фрагмента. Наряду с аллельными маркерами RFLP, маркер размера молекулярной массы, в данном случае ДНК-маркер [30] , также включен в гель агарозы с электорфорезом . Маркер ДНК позволяет оценить размер рестрикционных фрагментов.
Мини-спутники
Подобно RFLP, этот метод также использует эндонуклеазы рестрикции для переваривания геномной ДНК. Минисателлиты представляют собой короткие последовательности тандемных повторов, приблизительно 10-60 пар оснований. Минисателлиты можно использовать для снятия следов ДНК и в качестве регуляторов генного контроля. [28]

Маркеры на основе ПЦР (1980-е годы) [ править ]

Успех маркеров на основе ДНК привел к развитию ПЦР. ПЦР ( полимеразная цепная реакция ) - это метод амплификации ДНК , который можно применять к различным типам фрагментов. До этой разработки, чтобы амплифицировать ДНК, ее нужно было клонировать или изолировать. Вскоре после открытия ПЦР возникла идея использовать основанные на ПЦР маркеры для гель-электрофореза. Этот тип маркеров основан на праймерах ПЦР и классифицируется как полиморфизм последовательности ДНК . [28]

Электрофорезный гель с продуктами ПЦР. Самая левая полоса представляет собой лестницу ДНК с фрагментами с интервалами 100 п.н.
Микроспутники
Также известные как SSR ( простые повторы последовательности ) или STR ( короткие тандемные повторы ), микросателлиты отличаются от мини-сателлитов тем, что они короче, обычно 2-6 пар оснований. Это свойство микроспутников позволяет легко изолировать их. Микросателлиты чаще всего используются в популяционной генетике . Микросателлиты имеют высокую и сложную частоту мутаций, что является их основным недостатком. [28]
AFLP
Полиморфизм длины амплифицированного фрагмента - это метод снятия отпечатков ДНК на основе ПЦР . ДНК сначала переваривается эндонуклеазами. Затем рестрикционные фрагменты лигируют вместе. [31] Затем создается молекулярный маркер, когда для амплификации отбираются конкретные фрагменты . Маркеры AFLP наносятся на гель вместе с маркером ДНК. Обычный ДНК-маркер AFLP имеет длину 30–330 п.н. [32] Для повышения точности фрагменты этого маркера лежат с интервалом 10 п.н.
RAPD
Метод случайной амплификации полиморфной ДНК аналогичен AFLP. Разница в том, что молекулярные маркеры генерируются случайным образом. [31] Наиболее распространенным маркером размера молекулярной массы для этого метода является лестница ДНК размером 1 КБ. [33] [34]

Полиморфизм последовательности ДНК [ править ]

Хотя технически говоря, полиморфизм последовательностей ДНК имеет место с момента использования RFLP в 1960-х годах, анализ значительно изменился с годами. Полиморфизм последовательности ДНК использует более старые методы, такие как RFLP, но в более крупном масштабе. Секвенирование происходит намного быстрее и эффективнее. Анализ автоматизирован, так как он использует метод, известный как секвенирование дробовика. Этот высокопроизводительный метод обычно используется в популяционной генетике. [28]

SNP
SNP ( однонуклеотидный полиморфизм ) используются для обнаружения вариаций одиночных нуклеотидов. Техника очень похожа на RFLP. SNP часто используются для популяционных генетических исследований. [35] После амплификации с помощью ПЦР эти небольшие фрагменты можно визуализировать с помощью гель-электрофореза, и снова ДНК-маркеры играют роль в определении длины фрагмента.

Анализ полисахаридов методом электрофореза в углеводном геле [ править ]

Углеводные маркеры используются в методике, известной как анализ полисахаридов с помощью электрофореза в углеводном геле (PACE), который представляет собой измеримый метод разделения. [36] Он позволяет анализировать продукты ферментативного гидролиза . [36] Он использовался в таких приложениях, как характеристика ферментов, участвующих в разложении гемицеллюлозы , определение структуры полисахаридов гемицеллюлозы и анализ ферментативного расщепления целлюлозных продуктов. [36]

PACE зависит от дериватизации, то есть превращения химического соединения в производное . [36] [37] Здесь представляют интерес моносахариды , олигосахариды и полисахариды. Они помечены на их восстанавливающих концах флуоресцентной меткой (т. Е. Флуорофором ). [36] Эта дериватизация с помощью флуорофора позволяет как разделение на геле при желаемых условиях, так и флуоресцентную визуализацию геля. В этом случае используется полиакриламидный гель. [36]

Как и в случае электрофореза ДНК, РНК и белков, маркеры анализируются вместе с интересующими образцами при электрофорезе в углеводном геле. [36] Маркеры состоят из олигосахаридов с известной молекулярной массой. Как и в образцах , представляющих интерес, маркер также derivitized с флуорофором ( как правило , с 8-амино - нафталин -1,3,6- trisulfonic кислоты (ANTS) или 2- aminoacridone ). [36]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Карлсон, Дэвид П. "Маркеры размера для электрофоретического анализа ДНК" . Патент США № 5316908A . Патенты Google . Проверено 30 октября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  2. ^ Карлсон, Дэвид П. "Маркеры размера для электрофоретического анализа ДНК" . Патент EP № 0466404B1 . Патенты Google . Проверено 30 октября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  3. ^ Б с д е е г ч я J к л м п о р Blaber, Mike. «Лекция 20: Гель-электрофорез» . BCH5425 Молекулярная биология и биотехнология .
  4. ↑ Bowen, R (20 октября 1999 г.). «ДНК-лигирование» . Биотехнология и генная инженерия . Проверено 12 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  5. ^ a b c Лан, Во Тхи Тхуонг; Ссуда, Фам Тхи Тхань; Дуонг, Фам Ань Туи; Тхань, Ле Тхи; Ха, Нго Тхи; Туан, Та Бич (2012). «Простая процедура лабораторного производства ДНК-лестницы» . Журнал нуклеиновых кислот . 2012 : 254630. дои : 10,1155 / 2012/254630 . PMC 3306978 . PMID 22496965 .  
  6. ^ Б с д е е г Боуэна, R. (2000). «Электрофорез ДНК в агарозном геле» . Гипертексты для биомедицинских наук - Государственный университет Колорадо .
  7. ^ «Трис-борат ЭДТА и трис-ацетат-ЭДТА буфер (TAE и TBE, pH 8,3)» (PDF) . Аниара .
  8. ^ a b c "Советы и приемы электрофореза в агарозном геле" . Технологии жизни .
  9. ^ Хартли, Джеймс. «Маркерная лестница размера белка» . Патент США № 5449758A . Патенты Google . Проверено 30 октября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  10. ^ Ченг, Тянь Лу. «Саморазвивающийся и регулярно взвешиваемый набор маркеров молекулярной массы белка и метод его приготовления» . Патент США № 20130217133A1 . Патенты Google . Проверено 30 октября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  11. ^ "Маркер молекулярной массы предварительно окрашенного белка" . Термонаучный . Проверено 12 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  12. ^ Б с д е е Ingelman, Маргарета (2004). «Разделение и анализ белков» . KE7001 Биохимические лаборатории . Проверено 12 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  13. ^ «Маркеры молекулярной массы белка» . Помогите Биотех . 2011 . Проверено 12 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  14. ^ a b c d e f g h «Руководство по выбору маркеров молекулярной массы белков» . Проверено 16 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  15. ^ a b «Биотинилированный маркер молекулярной массы» . Проверено 16 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  16. ^ a b «Маркеры молекулярной массы» . Проверено 16 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  17. ^ a b «Маркер молекулярной массы предварительно окрашенного белка Pierce» . Проверено 16 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  18. ^ a b c d e f g h i j k l m n "Электрофорез. Руководство по электрофорезу и обнаружению в полиакриламидном геле" (PDF) . Bio-Rad .
  19. ^ «Руководство по сравнению и выбору маркеров молекулярной массы белков» . Термонаучный . Проверено 12 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  20. ^ a b c d e f g h i «Справочник по белкам 2013» (PDF) . Технологии жизни .
  21. ^ a b Коул, Эрик Т. "Круговые ДНК-векторы для синтеза РНК и ДНК" . Патент США № 6096880A . Патенты Google . Проверено 27 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  22. ^ Лонза. «РНК-маркеры 0,5–9 т.п.н.» (PDF) . Документ № 18123-0807-06 . Lonza Rockland Inc . Проверено 27 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  23. ^ Биолаборатории Новой Англии. «Маркер микроРНК» . Биолаборатории Новой Англии . Проверено 27 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  24. ^ Уикс, Ричард Дж. (1986). «Определение молекулярной массы РНК электрофорезом в агарозном геле с использованием формальдегида в качестве денатурирующего агента: Сравнение маркеров молекулярной массы РНК и ДНК». Международный журнал биохимии . 18 (3): 277–278. DOI : 10.1016 / 0020-711x (86) 90118-7 . PMID 2937672 . 
  25. ^ a b "Каталог №: R0004" . РНК-маркер High Easy . Абнова . Проверено 14 декабря 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  26. ^ «Электрофорез РНК: Введение» . РНК-электрофорез . Thermo Fisher Scientific Inc . Проверено 14 декабря 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  27. ^ «Определение молекулярной массы белков» (PDF) . Проверено 14 декабря 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  28. ^ a b c d e f g h Шлоттерер, Кристиан. «Эволюция молекулярных маркеров» (PDF) . Проверено 26 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  29. ^ «Улучшение населения» . Проверено 30 октября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  30. ^ Хиггинс, Л. (апрель 2012 г.). «ДНК-лестница для гель-электрофореза» . Колледж Льюиса и Кларка . Проверено 15 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  31. ^ a b Мюллер, Ульрих (1999). «Генотипирование AFLP и снятие отпечатков пальцев» (PDF) . Тенденции в экологии и эволюции . 14 (10): 389–394. DOI : 10.1016 / s0169-5347 (99) 01659-6 . PMID 10481200 . Проверено 30 октября 2013 года .   CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  32. ^ Invitrogen Corporation (2003). «30–330 п.н. AFLP® DNA Ladder» (PDF) . Руководство . Корпорация Life Technologies . Проверено 15 ноября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  33. ^ Джаннини, Кристина; и другие. (Май 2004 г.). «unRAPD анализ мтДНК из цветков томата без ядерных артефактов ДНК» (PDF) . Биотехнологии . 36 (5): 772–776. DOI : 10.2144 / 04365BM04 . PMID 15152595 . Проверено 15 ноября 2013 года .   CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  34. ^ Робертс, Массачусетс; Кроуфорд, DL (1 июня 2000 г.). «Использование случайно усиленной полиморфной ДНК как средство разработки генов и штаммов ДНК-зондов Streptomyces» . Прикладная и экологическая микробиология . 66 (6): 2555–2564. DOI : 10,1128 / AEM.66.6.2555-2564.2000 . PMC 110581 . PMID 10831438 .  
  35. ^ Макклин, Филипп. «Классы молекулярных маркеров» . Проверено 30 октября 2013 года . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  36. ^ a b c d e f g h Косик, Ондрей; Бромли, Дженнифер Р .; Буссе-Вичер, Марта; Чжан, Чжинун; Дюпри, Поль (2012). «Исследования ферментативного расщепления целлюлозы с использованием анализа полисахаридов с помощью электрофореза в углеводном геле (PACE)». Методы в энзимологии . 510 : 51–67. DOI : 10.1016 / B978-0-12-415931-0.00004-5 . ISBN 9780124159310. ISSN  0076-6879 . PMID  22608721 .
  37. ^ Cammack R, Этвуд Т.К., Кэмпбелл П.Н., приход HJ, Smith A, Stirling JL, Велла F (2006). «Флуорофор». Оксфордский словарь биохимии и молекулярной биологии (второе изд.). Издательство Оксфордского университета.