Обратная трансфекция - это метод переноса генетического материала в клетки . Поскольку ДНК печатается на предметном стекле, чтобы процесс трансфекции (преднамеренное введение нуклеиновых кислот в клетки) происходил до добавления прикрепленных клеток, порядок добавления ДНК и прикрепленных клеток является обратным по сравнению с обычной трансфекцией . [1] Следовательно, используется слово «обратный».
Процесс [ править ]
Подготовка трансфекционной смеси для печати слайдов [ править ]
ДНК -gelatin смеси могут быть использованы для печати на слайд. Порошок желатина сначала растворяют в стерильной воде Milli-Q, чтобы получить 0,2% раствор желатина. Затем очищенную плазмиду ДНК смешивают с раствором желатина, и конечную концентрацию желатина поддерживают выше 0,17%. Помимо желатина, ателоколлаген и фибронетин также являются успешными векторами трансфекции для введения чужеродной ДНК в ядро клетки.
Слайд-печать смеси ДНК и желатина [ править ]
После приготовления смеси ДНК-желатин смесь переносят пипеткой на поверхность предметного стекла и помещают в закрытую чашку Петри . В посуду добавляют влагопоглотитель, чтобы высушить раствор. Наконец, культивированные клетки выливают в чашку для захвата плазмиды. Однако с изобретением различных типов систем печати на микрочипах сотни смесей для трансфекции (содержащих разные представляющие интерес ДНК) могут быть напечатаны на одном и том же предметном стекле для поглощения плазмид клетками. [2] Существует два основных типа систем печати на микрочипах, производимых разными компаниями: системы контактной и бесконтактной печати.
Примером системы бесконтактной печати является гибкая бесконтактная система микроматриц Piezorray. Он использует контроль давления и пьезоэлектрическую манжету для выдавливания постоянных капель объемом примерно 333 мкл. Дозаторы PiezoTip не контактируют с поверхностью, на которую наносится проба; таким образом снижается вероятность загрязнения и устраняется риск разрушения целевой поверхности. Пример контактной печатиСистема представляет собой контактно-точечную систему SpotArray 72 (Perkin Elmer Life Sciences). Его печатающая головка может вместить до 48 контактов и создает компактные массивы, выборочно поднимая и опуская подмножества контактов во время печати. После печати булавки промываются мощной струйной моечной машиной и сушатся в вакууме, что исключает унос. Другой пример системы контактной печати - система Qarray (Genetix). Имеет три типа систем печати: QArray Mini, QArray 2 и QArray Max. После печати раствору дают высохнуть, и ДНК-желатин плотно закрепляется на матрице.
HybriWell в обратной трансфекции [ править ]
Сначала снимается клей с HybriWell, и HybriWell прикрепляется к области слайда, напечатанной раствором желатиновой ДНК. Во-вторых, 200 мкл смеси для трансфекции вносят пипеткой в один из портов HybriWell; смесь равномерно распределится по массиву. Затем массив инкубируют, при этом температура и время зависят от используемых типов клеток. В-третьих, смесь для трансфекции переносится пипеткой и HybriWell удаляется с помощью щипцов с тонким наконечником . В-четвертых, отпечатанные слайды, обработанные реагентом для трансфекции, помещают в квадратную чашку печатной стороной вверх. В-пятых, собранные клетки аккуратно выливают на предметные стекла (а не на отпечатанные участки). Наконец, чашку помещают в инкубатор с увлажнением с 5% CO 2 при 37 ° C и инкубируют в течение ночи.
Другие реагенты для обратной трансфекции [ править ]
Реагент Effectene используется вместе с усилителем и буфером конденсации ДНК (Buffer EC) для достижения высокой эффективности трансфекции. На первой стадии образования комплекса эффектен-ДНК ДНК конденсируется за счет взаимодействия с энхансером в определенной буферной системе. Затем к конденсированной ДНК добавляется реагент эффектен для получения конденсированных комплексов эффектен-ДНК. Комплексы эффектен – ДНК смешивают со средой и добавляют непосредственно в клетки. Реагент Effectene спонтанно образует мицеллыструктуры, не имеющие различий по размеру или партии (как это можно обнаружить с предварительно приготовленными липосомными реагентами). Эта особенность обеспечивает воспроизводимость образования трансфекционного комплекса. Процесс высокой конденсации молекул ДНК с последующим покрытием их реагентом Effectene - это эффективный способ переноса ДНК в эукариотические клетки .
Преимущества и недостатки [ править ]
Преимущества обратной трансфекции (по сравнению с обычной трансфекцией):
- Добавление и прикрепление клеток-мишеней к загруженной ДНК поверхности может привести к более высокой вероятности контакта клетки с ДНК, потенциально приводя к более высокой эффективности трансфекции. [3]
- Трудосберегающие материалы (требуется меньше ДНК)
- Скрининг с высокой пропускной способностью; сотни генов могут быть экспрессированы в клетках на одном микрочипе для изучения экспрессии и регуляции генов . [4]
- Параллельный посев клеток в одной камере для 384 экспериментов без физического разделения экспериментов повышает качество данных скрининга . В экспериментах, проводимых в многостенных чашках, наблюдаются вариации от лунки к лунке.
- Могут быть получены матрицы с точной репликацией, поскольку одна и та же пластина источника образца может быть высушена и напечатана на разных предметных стеклах в течение как минимум 15 месяцев хранения без видимой потери эффективности трансфекции.
Недостатки обратной трансфекции:
- Обратная трансфекция стоит дороже, потому что для печати раствора ДНК-желатин на предметных стеклах требуется высокоточная и эффективная система печати микрочипов.
- Приложения с различными клеточными линиями (до сих пор) требовали вариаций протокола для производства миРНК или массивов плазмид, что требует значительных разработок и испытаний.
- Повышенная вероятность перекрестного загрязнения матрицы и пятна при увеличении плотности пятна; поэтому важна оптимизация компоновки массива. [5]
Ссылки [ править ]
- ^ «Обратное преобразование» . Проверено 24 августа 2018 года .
- ^ Reverse Трансфекция Главная Проверено 2011-10-14.
- ^ Эрфле, Х. и др. (2007), "Обратная трансфекция клеточных массивов для скрининга высокого содержания ". Микроскопия, Nat Protoc 2 , 392–399.
- ^ Neumann B et al., "Высокопроизводительный скрининг РНКи с помощью покадровой визуализации живых клеток человека ". Nat Methods 3, 385–390 (2006).
- ^ Линии раковых клеток и первичные клетки, получено 14 октября 2011 г.