Чувствительные к напряжению красители , также известные как потенциометрические красители , представляют собой красители, которые изменяют свои спектральные свойства в ответ на изменения напряжения . Они способны обеспечить линейные измерения активности возбуждения отдельных нейронов , больших популяций нейронов или активности миоцитов . Многие физиологические процессы сопровождаются изменениями потенциала клеточной мембраны, которые можно обнаружить с помощью красителей, чувствительных к напряжению. Измерения могут указывать на место возникновения потенциала действия, и могут быть получены измерения скорости и направления потенциала действия. [1]
Потенциометрические красители используются для мониторинга электрической активности внутри клеточных органелл, где невозможно вставить электрод , таких как митохондрии и дендритный позвоночник . Эта технология особенно эффективна для изучения паттернов активности сложных многоклеточных препаратов. Это также делает возможным измерение пространственных и временных изменений мембранного потенциала вдоль поверхности отдельных клеток.
Виды красителей
Зонды с быстрым откликом: это амфифильные окрашивающие мембраны красители, которые обычно имеют пару углеводородных цепей, действующих как якоря мембраны, и гидрофильную группу, которая выравнивает хромофор перпендикулярно границе раздела мембрана / вода. Считается, что хромофор претерпевает большой сдвиг электронного заряда в результате возбуждения из основного в возбужденное состояние, и это лежит в основе предполагаемого электрохромного механизма чувствительности этих красителей к мембранному потенциалу. Эта молекула (краситель) внедряется в липофильную часть биологических мембран . Такая ориентация гарантирует, что индуцированное возбуждением перераспределение заряда будет происходить параллельно электрическому полю внутри мембраны. Таким образом, изменение напряжения на мембране вызовет спектральный сдвиг в результате прямого взаимодействия между полем и дипольными моментами основного и возбужденного состояний .
Новые красители напряжения могут определять напряжение с высокой скоростью и чувствительностью с помощью фотоиндуцированного переноса электронов (PeT) через сопряженную молекулярную проволоку. [2] [3]
Зонды с медленным откликом: они демонстрируют потенциально-зависимые изменения в их трансмембранном распределении, которые сопровождаются изменением флуоресценции. Типичные зонды медленного отклика включают катионные carbocyanines и родамины , а также ионное oxonols .
Примеры
Обычно используемые красители, чувствительные к напряжению, представляют собой замещенные аминонафтилэтенилпиридиновые (ANEP) красители, такие как ди-4-ANEPPS, ди-8-ANEPPS и RH237. В зависимости от их химических модификаций, которые изменяют их физические свойства, они используются для различных экспериментальных процедур. [4] Впервые они были описаны в 1985 году исследовательской группой Лесли Лоу. [5] ANNINE-6plus - новейший чувствительный к напряжению краситель с быстрым откликом ( время отклика нс ) и высокой чувствительностью к напряжению . Он был применен для измерения потенциалов действия одного t-канальца кардиомиоцитов Guixue Bu et al. [6] Недавнее вычислительное исследование подтвердило, что на красители ANEP влияет только электростатическая среда, а не специфические молекулярные взаимодействия. [7]
Материалы
Основным материалом для визуализации активности мозга с помощью чувствительных к напряжению красителей являются сами красители. Эти чувствительные к напряжению красители являются липофильными и предпочтительно локализуются в мембранах с их гидрофобными хвостами. Они используются в приложениях, связанных с флуоресценцией или поглощением; они быстродействующие и могут обеспечивать линейные измерения изменений мембранного потенциала. [8]
В сочетании с красителями может использоваться различное специализированное оборудование, и выбор оборудования будет варьироваться в зависимости от особенностей препарата. По сути, оборудование будет включать в себя специализированные микроскопы и устройства формирования изображений, а также могут включать технические лампы или лазеры. [8]
Сильные и слабые стороны
Сильные стороны визуализации мозговой активности с помощью чувствительных к напряжению красителей включают следующие возможности:
- Измерение сигналов популяции из многих областей может проводиться одновременно, и могут быть записаны сотни нейронов. Такие многосайтовые записи могут предоставить точную информацию о возникновении и распространении потенциала действия (включая направление и скорость), а также обо всей ветвящейся структуре нейрона. [8]
- Можно измерить спайковую активность в ганглии, вызывающей поведение, и они могут предоставить информацию о том, как это поведение вызывает. [8]
- В некоторых препаратах фармакологические эффекты красителей могут быть полностью обращены, если удалить пипетку для окрашивания и дать нейрону 1-2 часа для восстановления. [8]
- Красители можно использовать для анализа интеграции сигналов в терминальных дендритных ветвях. Красители, чувствительные к напряжению, являются единственной альтернативой генетически кодируемым протеинам, чувствительным к напряжению (таким как протеины, полученные из Ci-VSP ). [8]
К недостаткам визуализации мозговой активности с помощью чувствительных к напряжению красителей можно отнести следующие проблемы:
- Красители, чувствительные к напряжению, могут очень по-разному реагировать от одного препарата к другому; обычно десятки красителей должны быть протестированы для получения оптимального сигнала. [8] параметры изображения, такие как длина волны возбуждения, длина волны излучения, время экспозиции, также должны быть оптимизированы.
- Чувствительные к напряжению красители часто не могут проникать через соединительную ткань или перемещаться через внутриклеточные пространства к желаемой для исследования области мембраны. [8] При нанесении этих красок серьезной проблемой является окрашивание. Водорастворимые красители, такие как ANNINE-6plus , не страдают этой проблемой.
- Шум является проблемой для всех препаратов с чувствительными к напряжению красителями, а в некоторых препаратах сигнал может быть значительно затемнен. [8] Отношение сигнал / шум можно улучшить с помощью алгоритмов пространственной или временной фильтрации. Существует множество таких алгоритмов; один алгоритм обработки сигналов можно найти в недавней работе с красителем ANNINE-6plus. [6]
- Лечение может необратимо повлиять на клетки. Возможны длительные фармакологические эффекты, а фотодинамика красителей может быть разрушительной. [8]
Использует
Напряжение чувствительные красители были использованы для измерения нейронной активности в нескольких областях центральной нервной системы в различных организмов, в том числе кальмаров гигантского аксона , [9] усов баррелей крысы соматосенсорной коры, [10] [11] обонятельную луковицу из саламандра, [12] [13] [14] зрительная кора кошки, [15] оптическая оболочка лягушки, [16] и зрительная кора головного мозга макаки-резуса . [17] [18]
Рекомендации
- Потенциометрические красители: визуализация электрической активности клеточных мембран . Лесли М. Лоу. Pure & Appl. Черн., Т. 68, No. 7, pp. 1405–1409.1996.
- ^ Коэн LB, Зальцберг BM (1978). Оптическое измерение мембранного потенциала . Обзоры физиологии, биохимии и фармакологии . 83 . С. 35–88. DOI : 10.1007 / 3-540-08907-1_2 . ISBN 978-3-540-08907-0.
- ^ Вудфорд, Клиффорд; Цзянь, Роджер (2015). "Предыдущая статья Следующая статья Содержание Улучшенные молекулы PeT для оптического измерения напряжения в нейронах" . Варенье. Chem. Soc . 137 (5): 1817–1824. DOI : 10.1021 / ja510602z . PMC 4513930 . PMID 25584688 .
- ^ Сырбу, Думитру; Мясник, Джон Б.; Waddell, Paul G .; Андраш, Питер; Беннистон, Эндрю С. (2017). "Локально возбужденные красители, связанные с переносом заряда в качестве оптически чувствительных нейронных пробников" . Химия - европейский журнал . 23 (58): 14639–14649. DOI : 10.1002 / chem.201703366 . ISSN 1521-3765 .
- ^ «Паспорт коммерческого поставщика красителей ANEP» (PDF) .
- ^ Флюлер Э., Бернхэм В.Г., Лоу Л.М. (октябрь 1985 г.). «Спектры, связывание с мембраной и потенциометрические ответы новых зондов сдвига заряда». Биохимия . 24 (21): 5749–55. DOI : 10.1021 / bi00342a010 . PMID 4084490 .
- ^ а б Bu G, et al. (Март 2009 г.). «Равномерная реполяризация потенциала действия в сарколемме кардиомиоцитов желудочков in situ» . Биофизический журнал . 96 (6): 2532–2546. Bibcode : 2009BpJ .... 96.2532B . DOI : 10.1016 / j.bpj.2008.12.3896 . PMC 2907679 . PMID 19289075 .
- ^ Робинсон, Дэвид; Besley, Nicholas A .; О'Ши, Пол; Херст, Джонатан Д. (14 апреля 2011 г.). «Спектры эмиссии Di-8-ANEPPS в мембранах фосфолипидов / холестерина: теоретическое исследование». Журнал физической химии B . 115 (14): 4160–4167. DOI : 10.1021 / jp1111372 . PMID 21425824 .
- ^ Б с д е е г ч я J Бейкер Б.Дж., Космидис Е.К., Вучинич Д. и др. (Март 2005 г.). «Визуализация мозговой активности с помощью красителей, чувствительных к напряжению и кальций». Клетка. Мол. Neurobiol . 25 (2): 245–82. DOI : 10.1007 / s10571-005-3059-6 . PMID 16050036 .
- ^ Гринвальд А., Хильдесхайм Р. (2004). «VSDI: новая эра в функциональной визуализации корковой динамики». Обзоры природы Неврология . 5 (11): 874–85. DOI : 10.1038 / nrn1536 . PMID 15496865 .
- ^ Петерсен CC и др. (2003). «Пространственно-временная динамика сенсорных ответов в слое 2/3 ствола коры головного мозга крысы, измеренная in vivo с помощью визуализации чувствительного к напряжению красителя в сочетании с записями напряжения всей клетки и реконструкциями нейронов» . J. Neurosci . 23 (4): 1298–309. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.23-04-01298.2003 . PMID 12598618 .
- ^ Петерсен CC, Сакманн B (2001). «Функционально независимые столбцы соматосенсорной стволовой коры крысы выявлены с помощью визуализации чувствительного к напряжению красителя» . J. Neurosci . 21 (21): 8435–46. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.21-21-08435.2001 . PMID 11606632 .
- ^ Cinelli AR, et al. (1995). «Активность нейронов обонятельной луковицы саламандры, наблюдаемая с помощью видео скорости, визуализации чувствительного к напряжению красителя. III. Пространственные и временные свойства ответов, вызванных стимуляцией одорантом». J. Neurophysiol . 73 (5): 2053–71. DOI : 10,1152 / jn.1995.73.5.2053 . PMID 7542699 .
- ^ Cinelli AR, Kauer JS (1995). «Активность нейронов обонятельной луковицы саламандры, наблюдаемая с помощью видео скорости, визуализации чувствительного к напряжению красителя. II. Пространственные и временные свойства ответов, вызванных электрической стимуляцией». J. Neurophysiol . 73 (5): 2033–52. DOI : 10,1152 / jn.1995.73.5.2033 . PMID 7623098 .
- ^ Cinelli AR, et al. (1995). «Активность нейронов обонятельной луковицы саламандры, наблюдаемая с помощью видеосигнала, визуализации чувствительного к напряжению красителя. I. Характеристика записывающей системы». J. Neurophysiol . 73 (5): 2017–32. DOI : 10,1152 / jn.1995.73.5.2017 . PMID 7542698 .
- ^ Ариэли А. и др. (1996). «Динамика продолжающейся активности: объяснение большой вариабельности вызванных корковых ответов». Наука . 273 (5283): 1868–71. Bibcode : 1996Sci ... 273.1868A . DOI : 10.1126 / science.273.5283.1868 . PMID 8791593 .
- ^ Гринвальд А. и др. (1984). «Оптическое изображение в реальном времени вызванной естественным образом электрической активности интактного мозга лягушки». Природа . 308 (5962): 848–50. Bibcode : 1984Natur.308..848G . DOI : 10.1038 / 308848a0 . PMID 6717577 .
- ^ Slovin H, et al. (2002). «Долгосрочная визуализация чувствительного к напряжению красителя показывает корковую динамику поведения обезьян». J. Neurophysiol . 88 (6): 3421–38. DOI : 10,1152 / jn.00194.2002 . PMID 12466458 .
- ^ Seidemann E, et al. (2002). «Динамика деполяризации и гиперполяризации лобной коры и цели саккад». Наука . 295 (5556): 862–5. Bibcode : 2002Sci ... 295..862S . CiteSeerX 10.1.1.386.4910 . DOI : 10.1126 / science.1066641 . PMID 11823644 .