Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлен с двумерного электрофореза )
Перейти к навигации Перейти к поиску
2D-гели (окрашенные кумасси)
Роботы используются для выделения белковых пятен из 2D-гелей в современных лабораториях.

Двумерный гель-электрофорез , сокращенно 2-DE или 2-D-электрофорез , представляет собой форму гель-электрофореза, обычно используемую для анализа белков . Смеси белков разделены двумя свойствами в двух измерениях на 2D-гелях. 2-DE был впервые независимо введен О'Фарреллом [1] и Клозе [2] в 1975 году.

Основание для разделения [ править ]

2-Д - электрофорез начинается с электрофорезом в первом измерении , а затем отделяет молекулы перпендикулярно от первой , чтобы создать electropherogram во втором измерении. При электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой. Во втором измерении молекулы затем разделяются под углом 90 градусов от первой электрофореграммы в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут похожи по двум различным свойствам, молекулы более эффективно разделяются при 2-мерном электрофорезе, чем при 1-мерном электрофорезе.

Двумя измерениями, на которые разделяются белки с помощью этого метода, могут быть изоэлектрическая точка , масса белкового комплекса в нативном состоянии или масса белка .

Разделение белков по изоэлектрической точке называется изоэлектрическим фокусированием (IEF). Таким образом, к гелю применяется градиент pH, и электрический потенциал прикладывается к гелю, делая один конец более положительным, чем другой. При всех значениях pH, кроме их изоэлектрической точки, белки будут заряжаться. Если они заряжены положительно, они будут тянуться к более отрицательному концу геля, а если они заряжены отрицательно, они будут притягиваться к более положительному концу геля. Белки, нанесенные в первом измерении, будут двигаться по гелю и накапливаться в своей изоэлектрической точке; то есть точка, в которой общий заряд белка равен 0 (нейтральный заряд).

Для анализа функционирования белков в клетке важно знание их взаимодействия. Чаще всего белки действуют вместе в комплексах, чтобы быть полностью функциональными. Анализ этой суборганической организации клетки требует методов, сохраняющих естественное состояние белковых комплексов . При электрофорезе в нативном полиакриламидном геле ( нативный PAGE ) белки остаются в своем нативном состоянии и разделяются в электрическом поле в соответствии с их массой и массой их комплексов соответственно. Чтобы получить разделение по размеру, а не по чистому заряду, как в IEF, дополнительный заряд переносится на белки с помощью кумасси бриллиантового синего.или додецилсульфат лития. После завершения первого измерения комплексы разрушаются путем применения денатурирующего SDS-PAGE во втором измерении, где белки, из которых состоят комплексы, разделяются по своей массе.

Перед разделением белков по массе их обрабатывают додецилсульфатом натрия (SDS) вместе с другими реагентами ( SDS-PAGEв 1-D). Это денатурирует белки (то есть разворачивает их в длинные прямые молекулы) и связывает ряд молекул SDS, примерно пропорциональных длине белка. Поскольку длина белка (в развернутом виде) примерно пропорциональна его массе, это эквивалентно тому, что он присоединяет количество молекул SDS, примерно пропорциональное массе белка. Поскольку молекулы SDS заряжены отрицательно, в результате все белки будут иметь примерно одинаковое соотношение массы к заряду друг с другом. Кроме того, белки не будут мигрировать, когда у них нет заряда (в результате этапа изоэлектрической фокусировки), поэтому покрытие белка в SDS (отрицательно заряженном) позволяет переносить белки во втором измерении (SDS-PAGE,он несовместим для использования в первом измерении, поскольку он заряжен и необходимо использовать неионогенное или цвиттерионное моющее средство). Во втором измерении снова прикладывается электрический потенциал, но под углом 90 градусов к первому полю. Белки будут притягиваться к более положительной стороне геля (потому что SDS заряжен отрицательно) пропорционально их соотношению массы к заряду. Как объяснялось ранее, это соотношение будет почти одинаковым для всех белков. Продвижение белков будет замедляться силами трения. Таким образом, гель действует как молекулярное сито при приложении тока, разделяя белки на основе их молекулярной массы, при этом более крупные белки удерживаются выше в геле, а более мелкие белки могут проходить через сито и достигать нижних областей геля. .но под углом 90 градусов к первому полю. Белки будут притягиваться к более положительной стороне геля (потому что SDS заряжен отрицательно) пропорционально их соотношению массы к заряду. Как объяснялось ранее, это соотношение будет почти одинаковым для всех белков. Продвижение белков будет замедляться силами трения. Таким образом, гель действует как молекулярное сито при приложении тока, разделяя белки на основе их молекулярной массы, при этом более крупные белки удерживаются выше в геле, а более мелкие белки могут проходить через сито и достигать нижних областей геля. .но под углом 90 градусов к первому полю. Белки будут притягиваться к более положительной стороне геля (потому что SDS заряжен отрицательно) пропорционально их соотношению массы к заряду. Как объяснялось ранее, это соотношение будет почти одинаковым для всех белков. Продвижение белков будет замедляться силами трения. Таким образом, гель действует как молекулярное сито при приложении тока, разделяя белки на основе их молекулярной массы, при этом более крупные белки удерживаются выше в геле, а более мелкие белки могут проходить через сито и достигать нижних областей геля. .это соотношение будет примерно одинаковым для всех белков. Продвижение белков будет замедляться силами трения. Таким образом, гель действует как молекулярное сито при приложении тока, разделяя белки на основе их молекулярной массы, при этом более крупные белки удерживаются выше в геле, а более мелкие белки могут проходить через сито и достигать нижних областей геля. .это соотношение будет примерно одинаковым для всех белков. Продвижение белков будет замедляться силами трения. Таким образом, гель действует как молекулярное сито при приложении тока, разделяя белки на основе их молекулярной массы, при этом более крупные белки удерживаются выше в геле, а более мелкие белки могут проходить через сито и достигать нижних областей геля. .

Обнаружение белков [ править ]

В результате получается гель с распределенными по его поверхности белками. Затем эти белки можно обнаружить различными способами, но чаще всего используются окраски серебром и кумасси бриллиантовым синим . В первом случае на гель наносится коллоид серебра. Серебро связывается с цистеиновыми группами в белке. Серебро темнеет под воздействием ультрафиолетового света. Количество серебра может быть связано с темнотой и, следовательно, с количеством белка в данном месте геля. Это измерение может дать только приблизительные суммы, но подходит для большинства целей. Окрашивание серебром в 100 раз более чувствительно, чем кумасси бриллиантовый синий, с 40-кратным диапазоном линейности. [3]

Молекулы, отличные от белков, можно разделить с помощью 2D-электрофореза. В анализах суперспирализации спиральная ДНК разделяется в первом измерении и денатурируется интеркалятором ДНК (таким как бромид этидия или менее канцерогенный хлорохин ) во втором. Это сопоставимо с комбинацией нативного PAGE / SDS-PAGE при разделении белков.

Общие техники [ править ]

IPG-DALT [ править ]

Распространенным методом является использование иммобилизованного градиента pH (IPG) в первом измерении. Этот метод называется IPG-DALT . Образец сначала разделяют на гель IPG (который имеется в продаже), затем гель разрезают на срезы для каждого образца, который затем уравновешивают в SDS-меркаптоэтаноле и наносят на гель SDS-PAGE для разрешения во втором измерении. Обычно IPG-DALT не используется для количественного определения белков из-за потери низкомолекулярных компонентов во время переноса на гель SDS-PAGE. [4]

IEF SDS-PAGE [ править ]

См. Изоэлектрическую фокусировку

Программное обеспечение для 2D-анализа гелей [ править ]

Основная статья: Программное обеспечение для 2D-анализа гелей
Деформация: изображения двух 2D-гелей для электрофореза, наложенные Delta2D . Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе - в синий. Из-за различий хода соответствующие точки не перекрываются.
Деформация: изображения двух двухмерных гелей для электрофореза после деформации. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе - в синий. Соответствующие пятна перекрываются после коробления. Обычные пятна окрашены в черный цвет, оранжевые пятна присутствуют (или намного сильнее) только на первом изображении, синие пятна присутствуют (или намного сильнее) на втором изображении.

В количественной протеомике эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры путем количественной оценки отдельных белков и отображения разделения между одним или несколькими белковыми «пятнами» на сканированном изображении геля 2-DE. Кроме того, эти инструменты сопоставляют пятна между гелями схожих образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранней и поздней стадиями заболевания. Пакеты программного обеспечения включают, среди прочего, Delta2D, ImageMaster, Melanie, PDQuest, Progenesis и REDFIN. [ необходима цитата ] Хотя эта технология широко используется, интеллект еще не доведен до совершенства. Например, хотя PDQuest и Progenesis имеют тенденцию согласовывать количественную оценку и анализ четко определенных четко разделенных белковых пятен, они дают разные результаты и тенденции анализа с менее выраженными, менее разделенными пятнами. [5]

Проблемы автоматического программного анализа включают не полностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее определенные и / или разделенные), слабые места / шум (например, «пятна-призраки»), различия между гелями (например, белок перемещается в разные положения на различные гели), несогласованные / необнаруженные пятна, приводящие к отсутствующим значениям , [6] [7] несовпадающие пятна, ошибки в количественной оценке (несколько отдельных пятен могут быть ошибочно обнаружены программным обеспечением как единое пятно и / или части пятна могут быть исключены из количественной оценки), а также различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, тенденции анализа

Сгенерированные списки выбора можно использовать для автоматического расщепления белковых пятен в геле и последующей идентификации белков с помощью масс-спектрометрии . Масс-спектрометрический анализ может идентифицировать точные измерения массы наряду с секвенированием пептидов в диапазоне от 1000 до 4000 атомных единиц массы. [8] Для обзора текущего подхода к программному анализу изображений геля 2DE см. [9] или. [10]

См. Также [ править ]

  • Различие гель-электрофореза
  • QPNC-PAGE
  • ПРОТОКАРТА

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ O'Farrell, PH (1975). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения» . J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21. DOI : 10.1016 / S0021-9258 (19) 41496-8 . PMC  2874754 . PMID  236308 .
  2. Перейти ↑ Klose, J (1975). «Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих» . Humangenetik . 26 (3): 231–43. DOI : 10.1007 / bf00281458 (неактивный 2021-01-16). PMID 1093965 . CS1 maint: DOI неактивен с января 2021 г. ( ссылка )
  3. ^ Switzer RC третьих, Меррил CR, Шифрин S (1979). «Высокочувствительный серебряный краситель для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия . 98 (1): 231–37. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (79) 90732-2 . PMID 94518 . CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  4. ^ Миккельсен, Сьюзен; Кортон, Эдуардо (2004). Биоаналитическая химия . John Wiley & Sons, Inc. стр. 224 . ISBN 978-0-471-62386-1.
  5. ^ Арора ПС, ЯМАГИВА Н, Шривастава А, Боландер М, Саркар G (2005). «Сравнительная оценка двух программных приложений для анализа изображений двумерного гель-электрофореза с использованием синовиальной жидкости от пациентов с заболеваниями суставов». J Orthop Sci . 10 (2): 160–66. DOI : 10.1007 / s00776-004-0878-0 . PMID 15815863 . S2CID 45193214 .  
  6. ^ Педрески Р., Хертог М.Л., Карпентье С.К. и др. (Апрель 2008 г.). «Обработка пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Протеомика . 8 (7): 1371–83. DOI : 10.1002 / pmic.200700975 . hdl : 1942/8262 . PMID 18383008 . S2CID 21152053 .  
  7. ^ Какие значения отсутствуют и почему они представляют собой проблему?
  8. ^ Lepedda, Антонио Дж и Marilena Formato. «Применение технологии двумерного электрофореза для изучения атеросклероза». EJIFCC vol. 19,3 146-59. 20 декабря 2008 г.
  9. ^ Причал М, Moser FM, Кольбе M, Бернхард J (октябрь 2007). «Современное состояние анализа двумерных изображений гель-электрофореза» . Прил. Microbiol. Biotechnol . 76 (6): 1223–43. DOI : 10.1007 / s00253-007-1128-0 . PMC 2279157 . PMID 17713763 .  
  10. ^ Бандоу JE, Бейкер JD, Причал М., и др. (Август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для 2-D гелей позволяет проводить крупномасштабные исследования протеомики на основе 2-D гелей - исследование по обнаружению биомаркеров ХОБЛ». Протеомика . 8 (15): 3030–41. DOI : 10.1002 / pmic.200701184 . PMID 18618493 . S2CID 206361897 .  

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы библиотеки о
двумерном гель-электрофорезе
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • JVirGel Создавайте виртуальные двухмерные гели из данных последовательности.
  • Gel IQ Бесплатный загружаемый программный инструмент для оценки качества данных анализа двухмерных изображений геля.
  • Руководство по принципам и методам двумерного электрофореза