АТФ-связывающий кассетный транспортер

ABC Transporter, NBD
Транспортер витамина B 12 , BtuCD PDB 1l7v
Идентификаторы
Символ	ABC_tran
Pfam	PF00005
ИнтерПро	IPR003439
PROSITE	PDOC00185
SCOP2	1b0u / SCOPe / SUPFAM
TCDB	3.A.1
OPM суперсемейство	17
Белок OPM	3g5u
Доступные белковые структуры: Pfam   структуры / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum резюме структуры

Липид флиппаза MsbA

Комплекс молибдатного переносчика AB ₂ C ₂ , открытое состояние

В ATP -связывающих кассетные транспортеры ( ABC транспортеры ) представляют собой надсемейство транспортной системы , которая является одним из крупнейших и , возможно , один из старейших семейств генов . Он представлен во всех существующих типах , от прокариот до человека . ^{[1] [2] [3]}

Транспортеры ABC часто состоят из нескольких субъединиц, одна или две из которых являются трансмембранными белками, а одна или две - ассоциированными с мембраной АТФазами AAA . Субъединицы АТФазы используют энергию связывания и гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ), чтобы обеспечить энергию, необходимую для перемещения субстратов через мембраны, либо для поглощения, либо для экспорта субстрата.

Большинство систем захвата также имеют экстрацитоплазматический рецептор, белок, связывающий растворенные вещества. Некоторые гомологичные АТФазы участвуют в процессах, не связанных с транспортом, таких как трансляция РНК и репарация ДНК . ^{[4] [5]} ABC-транспортеры считаются надсемейством ABC на основании сходства последовательности и организации их доменов АТФ-связывающей кассеты (ABC), даже несмотря на то, что интегральные мембранные белки, по- видимому, эволюционировали независимо несколько раз, и таким образом, включают различные семейства белков. ^[6]Подобно экспортерам ABC, возможно, что интегральные мембранные белки систем захвата ABC также эволюционировали, по крайней мере, 3 раза независимо, на основании их трехмерных структур высокого разрешения. ^[7] Портеры поглощения ABC поглощают большое количество питательных веществ, биосинтетических предшественников, микроэлементов и витаминов , в то время как экспортеры транспортируют липиды , стерины , лекарства и большое количество первичных и вторичных метаболитов. Некоторые из этих экспортеров в организме человека участвуют в резистентности опухолей, муковисцидозеи ряд других наследственных заболеваний человека. Высокий уровень экспрессии генов, кодирующих некоторые из этих экспортеров, как в прокариотических, так и в эукариотических организмах (включая человека) приводит к развитию устойчивости ко многим лекарствам, таким как антибиотики и противораковые агенты.

Сотни переносчиков ABC были охарактеризованы как у прокариот, так и у эукариот. ^[8] Гены ABC необходимы для многих процессов в клетке, а мутации в генах человека вызывают или способствуют возникновению нескольких генетических заболеваний человека. ^[9] Сообщается о 48 генах ABC у людей. Среди них многие из них были охарактеризованы и показаны как причинно связанные с заболеваниями, присутствующими у людей, такими как муковисцидоз , адренолейкодистрофия , болезнь Штаргардта , лекарственно-устойчивые опухоли, синдром Дубина-Джонсона , болезнь Байлера, прогрессирующий знакомый внутрипеченочный холестаз, Х-сцепленный сидеробласт. анемия , атаксия, а также стойкая и гиперинсулименная гипогликемия. ^[8] ABC-переносчики также участвуют в формировании множественной лекарственной устойчивости , и именно так некоторые из них были впервые идентифицированы. Когда транспортные белки ABC сверхэкспрессируются в раковых клетках, они могут экспортировать противоопухолевые препараты и делать опухоли устойчивыми. ^[10]

Функция [ править ]

Транспортеры ABC используют энергию связывания и гидролиза АТФ для транспортировки различных субстратов через клеточные мембраны . Они разделены на три основные функциональные категории. У прокариот импортеры опосредуют поглощение питательных веществ клеткой. Субстраты, которые можно транспортировать, включают ионы , аминокислоты , пептиды , сахара и другие молекулы, которые в основном являются гидрофильными . Перекрывающая мембрану область переносчика ABC защищает гидрофильные субстраты от липидов двухслойной мембраны, обеспечивая, таким образом, путь через клеточную мембрану. Эукариотыне имеют импортеров. Экспортеры или эффлюксеры , которые присутствуют как у прокариот, так и у эукариот, действуют как насосы, выталкивающие токсины и лекарства из клетки. У грамотрицательных бактерий экспортеры транспортируют липиды и некоторые полисахариды из цитоплазмы в периплазму . Третья подгруппа белков ABC не функционирует как транспортеры, а скорее участвует в процессах трансляции и репарации ДНК. ^[4]

Прокариотический [ править ]

Бактериальные переносчики ABC важны для жизнеспособности, вирулентности и патогенности клеток . ^{[1] [4]} Системы поглощения железа ABC, например, являются важными эффекторами вирулентности. ^[11] Патогены используют сидерофоры , такие как энтеробактин , для удаления железа, которое находится в комплексе с высокоаффинными железосвязывающими белками или эритроцитами . Это высокоаффинные хелатирующие железо молекулы, которые секретируются бактериями и реабсорбируют железо в комплексы железо-сидерофор. ChvE-gguAB гена в Agrobacterium tumefaciens кодирует глюкозу и галактозуимпортеры, которые также связаны с вирулентностью. ^{[12] [13]} Транспортеры чрезвычайно важны для выживания клетки, так как они функционируют как белковые системы, противодействующие любым нежелательным изменениям, происходящим в клетке. Например, потенциальное смертельное увеличение осмотической силы уравновешивается активацией осмочувствительных переносчиков ABC, которые опосредуют поглощение растворенных веществ. ^[14] Помимо функции транспорта, некоторые бактериальные белки ABC также участвуют в регуляции ряда физиологических процессов. ^[4]

В системах бактериального оттока определенные вещества, которые необходимо экструдировать из клетки, включают поверхностные компоненты бактериальной клетки (например, капсульные полисахариды, липополисахариды и тейхоевую кислоту ), белки, участвующие в бактериальном патогенезе (например, гемолиз , гем- связывающий белок и щелочной протеаза ), гем, гидролитические ферменты , белки S-слоя, факторы компетентности, токсины , антибиотики , бактериоцины , пептидные антибиотики , лекарства и сидерофоры. ^[15]Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая биосинтез внеклеточных полисахаридов ^[16] и биогенез цитохрома . ^[17]

Эукариотический [ править ]

Хотя большинство эукариотических переносчиков ABC являются эффлюксерами, некоторые из них не принимают непосредственного участия в транспортировке субстратов. В трансмембранном регуляторе муковисцидоза ( CFTR ) и в рецепторе сульфонилмочевины (SUR) гидролиз АТФ связан с регуляцией открытия и закрытия ионных каналов, переносимых самим белком ABC или другими белками. ^[5]

Человеческие переносчики ABC вовлечены в несколько заболеваний, которые возникают из-за полиморфизма генов ABC и редко из-за полной потери функции отдельных белков ABC. ^[18] Такие заболевания включают Менделевские заболевания и сложные генетические расстройства , такие как муковисцидоз, адренолейкодистрофия , болезни Штаргардта , болезнь Танжера , иммунодефициты, прогрессирующий семейную intraheptic холестаз , синдром Дубины-Джонсон , эластическая псевдоксантома , стойкую гиперинсулинемическую гипогликемия младенчества в связи с фокальными аденоматозным гиперплазия , Х-сцепленнаясидеробластоз и анемия , возрастная дегенерация желтого пятна , семейная гипоапопротеинемия, пигментный ретинит, дистрофия колбочек и др. ^[5] Семейство ABCB человека (MDR / TAP) отвечает за множественную лекарственную устойчивость (MDR) к множеству структурно не связанных друг с другом лекарств. P-гликопротеин ABCB1 или MDR1 также участвует в других биологических процессах, для которых транспорт липидов является основной функцией. Было обнаружено, что он опосредует секрецию стероидного альдостерона надпочечниками, и его ингибирование блокирует миграцию дендритных иммунных клеток ^[19], возможно, связанную с внешним транспортом липидов.фактор активации тромбоцитов (PAF). Также сообщалось, что ABCB1 опосредует транспорт кортизола и дексаметазона , но не прогестерона в клетках, трансфицированных ABCB1. MDR1 также может транспортировать холестерин , короткоцепочечные и длинноцепочечные аналоги фосфатидилхолина (PC), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилсерина (PS), сфингомиелина (SM) и глюкозилцерамида.(GlcCer). Мультиспецифический транспорт различных эндогенных липидов через переносчик MDR1, возможно, может влиять на трансбислойное распределение липидов, в частности видов, обычно преобладающих на внутренней листке плазматической мембраны, таких как PS и PE. ^[18]

Совсем недавно было показано, что ABC-транспортеры существуют в плаценте , что указывает на то, что они могут играть защитную роль для развивающегося плода против ксенобиотиков . ^[20]

Структура [ править ]

Все транспортные белки ABC разделяют структурную организацию, состоящую из четырех основных доменов ^[21] . Эти домены состоят из двух трансмембранных (Т) доменов и двух цитозольных (А) доменов. Два Т-домена чередуются между ориентацией внутрь и наружу, и это чередование обеспечивается за счет гидролиза аденозинтрифосфата или АТФ . АТФ связывается с субъединицами А, а затем гидролизуется для обеспечения чередования, но точный процесс, посредством которого это происходит, неизвестен. Четыре домена могут присутствовать в четырех отдельных полипептидах , которые в основном встречаются у бактерий, или в одном или двух многодоменных полипептидах . ^[10]Когда полипептиды представляют собой один домен, их можно назвать полным доменом, а когда они представляют собой два мультидомена, их можно назвать половинным доменом. ^[9] Каждый Т-домен состоит из 10 альфа-спиралей, охватывающих мембрану, через которые транспортируемое вещество может проходить через плазматическую мембрану . Кроме того, структура T-доменов определяет специфичность каждого белка ABC. В конформации, обращенной внутрь, сайт связывания в домене A открыт непосредственно для окружающих водных растворов. Это позволяет гидрофильным молекулам проникать в сайт связывания непосредственно из внутренней створки фосфолипидного бислоя.. Кроме того, разрыв в белке доступен непосредственно из гидрофобного ядра внутреннего листка бислоя мембраны. Это позволяет гидрофобным молекулам проникать в сайт связывания непосредственно из внутренней створки фосфолипидного бислоя . После того, как АТФ переходит в обращенную наружу конформацию, молекулы высвобождаются из сайта связывания, и им позволяют уйти в экзоплазматический листок или непосредственно во внеклеточную среду . ^[10]

Общей чертой всех переносчиков ABC является то, что они состоят из двух отдельных доменов, трансмембранного домена (TMD) и нуклеотид-связывающего домена (NBD) . TMD, также известный как мембранный домен (MSD) или интегральный мембранный (IM) домен, состоит из альфа-спиралей , встроенных в бислой мембраны. Он распознает множество субстратов и претерпевает конформационные изменения, чтобы транспортировать субстрат через мембрану. Последовательность и архитектура TMD варьируются, отражая химическое разнообразие субстратов, которые могут перемещаться. С другой стороны, домен NBD или АТФ-связывающей кассеты (ABC) расположен в цитоплазме и имеет высококонсервативную последовательность. NBD - это сайт связывания АТФ. ^[22]У большинства экспортеров N-концевой трансмембранный домен и C-концевые домены ABC слиты в виде единой полипептидной цепи, организованной как TMD-NBD-TMD-NBD. Примером является экспортер гемолизина E. coli HlyB. Импортеры имеют инвертированную организацию, то есть NBD-TMD-NBD-TMD, где домен ABC является N-концевым, тогда как TMD является C-концевым, например, в белке MacB E. coli, ответственном за устойчивость к макролидам . ^{[4] [5]}

Структурная архитектура транспортеров ABC состоит как минимум из двух TMD и двух NBD. Четыре отдельные полипептидные цепи, включая две субъединицы TMD и две субъединицы NBD, могут объединяться с образованием полноценного переносчика, такого как в импортере BtuCD ^{[23] [24]} E. coli, участвующего в поглощении витамина B 12 . Большинство экспортеры, такие как в множественном лекарственном экспортере Sav1866 ^[25] из золотистого стафилококка , составлены из гомодимер , состоящий из двух половины транспортеров или мономеровTMD, слитого с нуклеотид-связывающим доменом (NBD). Для получения функциональности часто требуется полный транспортер. Некоторые транспортеры ABC имеют дополнительные элементы, которые вносят вклад в регуляторную функцию этого класса белков. В частности, импортеры имеют высокоаффинный связывающий белок (ВР), который специфически связывается с субстратом в периплазме для доставки к соответствующему переносчику ABC. Экспортеры не имеют связывающего белка, но имеют внутриклеточный домен (ICD), который соединяет мембранные спирали и домен ABC. Считается, что ICD отвечает за связь между TMD и NBD. ^[22]

Трансмембранный домен (TMD) [ править ]

Большинство транспортеров имеют трансмембранные домены, которые состоят всего из 12 α-спиралей с 6 α-спиралями на мономер. Поскольку TMD структурно разнообразны, некоторые транспортеры имеют разное количество спиралей (от шести до одиннадцати). ТМ домены подразделяются на три различные наборы складок: типа I ABC импортера , типа II ABC импортера и ABC экспортер складок. Классификация складок-импортеров основана на детальной характеристике последовательностей. ^[22]

Сворачивание импортера ABC типа I первоначально наблюдалось в субъединице ModB TM переносчика молибдата . ^[26] Эта диагностическая складка также может быть обнаружена в субъединицах MalF и MalG TM в MalFGK ₂ ^[27] и в транспортере Met MetI. ^[28] В транспортере MetI минимальный набор из 5 трансмембранных спиралей составляет эту складку, в то время как дополнительная спираль присутствует как для ModB, так и для MalG. Общая организация складки - это топология «вверх-вниз» спиралей TM2-5, которые выстилают путь транслокации, и спирали TM1, обернутой вокруг внешней, обращенной к мембране поверхности и контактирующей с другими спиралями TM.

Сворачивание импортера ABC типа II наблюдается в двадцати ТМ-спиральных доменах BtuCD ^[23] и в Hi1471, ^[29] гомологичном переносчике из Haemophilus influenzae.. В BtuCD упаковка спиралей сложна. Заметный паттерн состоит в том, что спираль TM2 расположена через центр субъединицы, где она окружена в непосредственной близости другими спиралями. Между тем, спирали TM5 и TM10 расположены в интерфейсе TMD. Перекрывающая мембрану область экспортеров ABC организована в два «крыла», которые состоят из спиралей TM1 и TM2 из одной субъединицы и TM3-6 из другой, в расположении с заменой домена. Характерной особенностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 посредством приблизительно двукратного вращения вокруг оси в плоскости мембраны. ^[22]

Изначально складка экспортера наблюдается в структуре Sav1866. Он содержит 12 спиралей TM, по 6 на мономер. ^[22]

Нуклеотид-связывающий домен (NBD) [ править ]

Домен ABC состоит из двух доменов: каталитического основного домена, подобного RecA- подобным моторным АТФазам, и меньшего структурно разнообразного α-спирального субдомена, который является уникальным для транспортеров ABC. Более крупный домен обычно состоит из двух β-листов и шести α-спиралей, где каталитический мотив Walker A (GXXGXGKS / T, где X - любая аминокислота) или P-петля и мотив Walker B (ΦΦΦΦD, из которых Φ - гидрофобный остаток ) расположен. Спиральный домен состоит из трех или четырех спиралей и мотива подписи ABC , также известного как мотив LSGGQ., линкерный пептид или мотив C. Домен ABC также имеет остаток глутамина, расположенный в гибкой петле, называемой петлей Q , крышкой или переключателем γ-фосфата, которая соединяет TMD и ABC. Предполагается, что Q-петля участвует во взаимодействии NBD и TMD, особенно в сочетании гидролиза нуклеотидов с конформационными изменениями TMD во время транслокации субстрата. Н мотив область или коммутатор содержит высоко консервативный гистидин остаток , который также имеет важное значение во взаимодействии домена ABC с АТФ. Название «АТФ-связывающая кассета» происходит от диагностического расположения складок или мотивов этого класса белков при образовании АТФ-сэндвича и гидролиза АТФ. ^{[4] [15][22]}

Связывание и гидролиз АТФ [ править ]

Для образования димеров двух доменов ABC транспортеров необходимо связывание АТФ. ^[30] Обычно наблюдается, что связанное с АТФ состояние связано с наиболее обширным интерфейсом между доменами ABC, тогда как структуры безнуклеотидных переносчиков демонстрируют конформации с большим разделением между доменами ABC. ^[22] Структуры АТФ-связанного состояния изолированных NBD описаны для импортеров, включая HisP, ^[31] GlcV, ^[32] MJ1267, ^[33] E. coli MalK (EcMalK), ^[34] T. litoralis MalK ( TlMalK), ^[35] и экспортеры, такие как TAP, ^[36] HlyB, ^[37] MJ0796, ^[38][39] Sav1866, ^[25] и MsbA. ^[40] В этих транспортерах АТФ связан с доменом ABC. Две молекулы АТФ расположены на границе раздела димера, зажаты между мотивом Уокера А одной субъединицы и мотивом LSGGQ другой. ^[22] Это было впервые обнаружено в Rad50 ^[41] и описано в структурах MJ0796, субъединицы NBD транспортера LolD из Methanococcus jannaschii ^[39] и EcMalK транспортера мальтозы. ^[34] Эти структуры также согласуются с результатами биохимических исследований, показывающих, что АТФ находится в тесном контакте с остатками в P-петле и мотиве LSGGQ во время катализа . ^[42]

Связывание нуклеотидов необходимо для обеспечения электростатической и / или структурной целостности активного сайта и содействия образованию активного димера NBD. ^[43] Связывание АТФ стабилизируется следующими взаимодействиями: (1) взаимодействие в виде стэкинга консервативного ароматического остатка, предшествующего мотиву Уокера A, и аденозиновое кольцо АТФ, ^{[44] [45]} (2) водородные связи между консервативный остаток лизина в мотиве Walker A и атомы кислорода β- и γ-фосфатов АТФ и координация этих фосфатов и некоторых остатков в мотиве Walker A с ионом Mg ²⁺ , ^{[32] [36]} и ( 3) координация γ-фосфата с боковой цепью серина и основной цепьюамидные группы остатков глицина в мотиве LSGGQ. ^[46] Кроме того, остаток, который предполагает тесную связь связывания и димеризации АТФ, представляет собой консервативный гистидин в H-петле. Этот гистидин связывается с остатками через интерфейс димера в мотиве Walker A и петле D, консервативной последовательности, следующей за мотивом Walker B. ^{[34] [39] [41] [47]}

Ферментативный гидролиз АТФ требует надлежащего связывания фосфатов и размещения γ-фосфата в атакующей воде. ^[22] В сайте связывания нуклеотидов атомы кислорода β- и γ-фосфатов АТФ стабилизируются остатками в мотиве Walker A ^{[48] [49]} и координируются с Mg ²⁺ . ^[22] Этот ион Mg ²⁺ также координируется с концевым остатком аспартата в мотиве Walker B через атакующую H ₂ O. ^{[32] [33] [38]} Общее основание, которое может быть остатком глутамата, соседним с Walker Мотив B, ^{[30] [39] [45]} глутамин в Q-петле ^{[29] [35] [39]} или гистидин в переключающей области, которая образует водородную связь с γ-фосфатом АТФ, катализирует скорость гидролиза АТФ, способствуя атакующему H ₂ O. ^{[34] [35] [39] [47]} Точный молекулярный механизм гидролиза АТФ до сих пор остается спорным. ^[4]

Механизм транспорта [ править ]

ABC-транспортеры являются активными транспортерами , то есть они используют энергию в форме аденозинтрифосфата (АТФ) для перемещения субстратов через клеточные мембраны. Эти белки используют энергию связывания АТФ и / или гидролиза, чтобы управлять конформационными изменениями в трансмембранном домене (TMD) и, следовательно, транспортировать молекулы. ^[50] Импортеры и экспортеры ABC имеют общий механизм транспортировки субстратов. Они похожи по своему строению. Модель, описывающая конформационные изменения, связанные со связыванием субстрата, представляет собой модель переменного доступа . В этой модели, субстрат связывание чередуется участок между outward- и обращенными внутрь конформациями. Относительное сродство связывания двух конформаций с субстратом в значительной степени определяет чистое направление транспорта. Для импортеров, поскольку транслокация направлена ​​из периплазмы в цитоплазму, обращенная наружу конформация имеет более высокое сродство связывания с субстратом. Напротив, аффинность связывания субстрата у экспортеров больше в обращенной внутрь конформации. ^[22] Модель, которая описывает конформационные изменения в нуклеотидсвязывающем домене (NBD) в результате связывания и гидролиза АТФ, является моделью переключения АТФ . Эта модель представляет две основные конформации NBD: образование замкнутого димера при связывании двух молекул АТФ и диссоциацию до открытого димера, чему способствует гидролиз АТФ и высвобождение неорганическогофосфат (P _i ) и аденозиндифосфат (ADP). Переключение между открытой и закрытой конформациями димера вызывает конформационные изменения в TMD, приводящие к транслокации субстрата. ^[51]

Общий механизм транспортного цикла ABC транспортеров не был полностью выяснен, но накоплены существенные структурные и биохимические данные, чтобы поддержать модель, в которой связывание и гидролиз АТФ сопряжено с конформационными изменениями в транспортере. В состоянии покоя все переносчики ABC имеют NBD в открытой димерной конфигурации с низким сродством к АТФ. Эта открытая конструкция имеет камеру, доступную для внутренней части транспортера. Транспортный цикл запускается связыванием субстрата с высокоаффинным сайтом на TMD, что вызывает конформационные изменения в NBD и усиливает связывание АТФ. Две молекулы АТФ связываются совместно, образуя замкнутую димерную конфигурацию. Закрытый димер NBD вызывает конформационные изменения в TMD, так что TMD открывается,образуя камеру с отверстием, противоположным исходному состоянию. Сродство субстрата к TMD снижается, тем самым высвобождая субстрат. Далее следует гидролиз АТФ, а затем последовательное высвобождение фосфора._i, а затем ADP восстанавливает транспортер до его базовой конфигурации. Хотя был предложен общий механизм, порядок связывания субстрата, связывания нуклеотидов и гидролиза, а также конформационных изменений, а также взаимодействия между доменами все еще обсуждается. ^{[4] [15] [18] [22] [40] [43] [50] [51] [52] [53] [54] »}

Несколько групп, изучающих ABC-транспортеры, имеют разные предположения о движущей силе функции транспортера. Обычно предполагается, что гидролиз АТФ обеспечивает основной подвод энергии или «силовой ход» для транспорта и что NBD действуют поочередно и, возможно, участвуют в различных стадиях транспортного цикла. ^[55]Однако недавние структурные и биохимические данные показывают, что связывание АТФ, а не гидролиз АТФ, обеспечивает «мощный удар». Также может быть, что, поскольку связывание АТФ запускает димеризацию NBD, образование димера может представлять собой «силовой удар». Кроме того, у некоторых транспортеров есть NBD, которые не обладают сходными способностями к связыванию и гидролизу АТФ, и то, что интерфейс димера NBD состоит из двух карманов связывания АТФ, предполагает одновременную функцию двух NBD в транспортном цикле. ^[51]

Сообщалось о некоторых доказательствах того, что связывание АТФ действительно является силовым ходом транспортного цикла. ^[51] Было показано, что связывание АТФ вызывает изменения в свойствах связывания с субстратом TMD. Сродство переносчиков ABC к субстратам трудно измерить напрямую, а косвенные измерения, например, посредством стимуляции активности АТФазы, часто отражают другие этапы, ограничивающие скорость. В последнее время , прямое измерение винбластин связывания с пермеазой -гликопротеина ( Р-гликопротеин ) в присутствии АТФ негидролизуемых аналогов, например , 5'-аденилатциклаз-β-γ-imidodiphosphate (АМР-ПНП), показал , что связывание АТФ, в отсутствии гидролиза, достаточно для снижения аффинности связывания субстрата. ^[56]Кроме того, связывание АТФ вызывает существенные конформационные изменения TMD. Спектроскопические , протеаза доступность и сшивающие исследования показали , что АТФ связывания с NBDs индуцирует конформационные изменения в множественной лекарственной резистентности-ассоциированный белок-1 (MRP1), ^[57] HisPMQ, ^[58] LmrA, ^[59] и Pgp. ^[60] Двумерные кристаллические структуры AMP-PNP-связанного Pgp показали, что основные конформационные изменения во время транспортного цикла происходят при связывании АТФ и что последующий гидролиз АТФ вносит более ограниченные изменения. ^[61]Вращение и наклон трансмембранных α-спиралей могут вносить вклад в эти конформационные изменения. Другие исследования были сосредоточены на подтверждении того, что связывание АТФ индуцирует образование закрытого димера NBD. Биохимические исследования интактных транспортных комплексов показывают, что конформационные изменения в NBD относительно невелики. В отсутствие АТФ NBD могут быть относительно гибкими, но они не вовлекают серьезную переориентацию NBD по отношению к другим доменам. Связывание АТФ вызывает жесткое вращение двух субдоменов ABC по отношению друг к другу, что обеспечивает правильное выравнивание нуклеотида в активном сайте и взаимодействие с обозначенными мотивами. Существуют убедительные биохимические доказательства того, что связывание двух молекул АТФ может быть кооперативным, то естьАТФ должен связываться с двумя карманами активного центра, прежде чем NBD смогут димеризоваться и образовать закрытую каталитически активную конформацию.^[51]

Импортеры ABC [ править ]

Большинство переносчиков ABC, которые опосредуют поглощение питательных веществ и других молекул бактериями, полагаются на высокоаффинный белок, связывающий растворенные вещества (BP). БП - растворимые белки, расположенные в периплазматическом пространстве между внутренней и внешней мембранами грамотрицательных бактерий . У грамположительных микроорганизмов отсутствует периплазма, поэтому их связывающий белок часто представляет собой липопротеин, связанный с внешней стороной клеточной мембраны . У некоторых грамположительных бактерий БП слиты с трансмембранным доменом самого переносчика. ^[4] Первой успешной рентгеновской кристаллической структурой неповрежденного импортера ABC является транспортер молибдена (ModBC-A) отArchaeoglobus fulgidus . ^[26] Структуры с атомным разрешением трех других бактериальных импортеров, E. coli BtuCD, ^[23] E. coli, переносчика мальтозы (MalFGK ₂ -E), ^[27] и предполагаемого металл-хелатного переносчика Haemophilus influenzae , HI1470 / 1 , ^[29]также были определены. Структуры предоставили подробные картины взаимодействия трансмембранного и ABC-доменов, а также выявили две разные конформации с отверстиями в двух противоположных направлениях. Другой общей чертой импортеров является то, что каждый NBD связан с одним TMD главным образом через короткую цитоплазматическую спираль TMD, «спираль сцепления». Эта часть петли EAA стыкуется с поверхностной щелью, образованной между RecA-подобными и спиральными субдоменами ABC, и лежит приблизительно параллельно бислою мембраны. ^[53]

Крупные импортеры ABC [ править ]

BtuCD и HI1470 / 1 классифицируются как крупные импортеры ABC (тип II). Трансмембранная субъединица витамина B ₁₂импортер, BtuCD, содержит 10 ТМ-спиралей, а функциональная единица состоит из двух копий каждого из нуклеотид-связывающего домена (NBD) и трансмембранного домена (TMD). TMD и NBD взаимодействуют друг с другом через цитоплазматическую петлю между двумя спиралями TM и петлей Q в ABC. В отсутствие нуклеотида два домена ABC свернуты, а интерфейс димера открыт. Сравнение структур со связывающим белком (BtuCDF) и без (BtuCD) показывает, что BtuCD имеет отверстие, обращенное к периплазме, тогда как в BtuCDF обращенная наружу конформация закрыта с обеих сторон мембраны. Структуры BtuCD и гомолога BtuCD, HI1470 / 1, представляют два различных конформационных состояния ABC-транспортера.Предполагаемый путь транслокации в BtuCD открыт в периплазму и закрыт на цитоплазматической стороне мембраны, в то время как путь транслокации HI1470 / 1 обращен в противоположном направлении и открыт только в цитоплазму. Разница в структурах заключается в повороте одной субъединицы ТМ на 9 ° относительно другой.^{[4] [22] [53]}

Малые импортеры ABC [ править ]

Структуры ModBC-A и MalFGK ₂ -E, которые находятся в комплексе со своим связывающим белком, соответствуют небольшим (тип I) импортерам ABC. TMD ModBC-A и MalFGK ₂-E имеет только шесть спиралей на субъединицу. Гомодимер ModBC-A находится в конформации, в которой субъединицы TM (ModB) ориентированы в перевернутой V-образной форме с полостью, доступной для цитоплазмы. Субъединицы ABC (ModC), с другой стороны, расположены в открытой конформации без нуклеотидов, в которой P-петля одной субъединицы обращена, но отделена от мотива LSGGQ другой. Связывающий белок ModA находится в закрытой конформации с субстратом, связанным в щели между его двумя долями и прикрепленным к внеклеточным петлям ModB, при этом субстрат находится непосредственно над закрытым входом транспортера. Структура MalFGK ₂ -E напоминает каталитическое переходное состояниедля гидролиза АТФ. Он находится в закрытой конформации, где он содержит две молекулы АТФ, зажатые между мотивами Walker A и B одной субъединицы и мотивом LSGGQ другой субъединицы. Белок, связывающий мальтозу (MBP или MalE), пристыкован к периплазматической стороне субъединиц TM (MalF и MalG), и на границе MalF и MalG можно обнаружить большую закупоренную полость. Спирали TM расположены в конформации, закрытой по отношению к цитоплазме, но с отверстием, обращенным наружу. Структура предполагает возможность того, что МВР может стимулировать АТФазную активность переносчика при связывании. ^{[4] [22] [53]}

Транспортный механизм для импортеров [ править ]

Механизм транспортировки для импортеров поддерживает модель переменного доступа. В состоянии покоя импортеры обращены внутрь, где интерфейс димера нуклеотидсвязывающего домена (NBD) удерживается открытым с помощью TMD и обращен наружу, но закрыт от цитоплазмы. При стыковке закрытого, нагруженного субстратом связывающего белка к периплазматической стороне трансмембранных доменов, АТФ связывается и димер NBD закрывается. Это переключает состояние покоя транспортера в обращенную наружу конформацию, в которой TMD переориентируются для приема субстрата из связывающего белка. После гидролиза АТФ димер NBD открывается, и субстрат высвобождается в цитоплазму. Выпуск ADP и P _iвозвращает транспортер в состояние покоя. Единственное несоответствие этого механизма модели АТФ-переключателя состоит в том, что конформация в его состоянии покоя, без нуклеотидов отличается от ожидаемой конформации, обращенной наружу. Хотя это так, ключевым моментом является то, что NBD не димеризуется, если АТФ и связывающий белок не связаны с транспортером. ^{[4] [15] [22] [51] [53]}

Экспортеры ABC [ править ]

Прокариотические экспортеры ABC многочисленны и имеют близких гомологов у эукариот. Этот класс переносчиков изучается в зависимости от типа транспортируемого субстрата. Один класс участвует в экспорте белков (например, токсинов , гидролитических ферментов , белков S-слоя, лантибиотиков , бактериоцинов и факторов компетентности), а другой - в оттоке лекарств. Транспортеры ABC привлекли большое внимание, потому что они способствуют устойчивости клеток к антибиотикам и противоопухолевым агентам , выкачивая лекарства из клеток. ^{[1] [62] [4]} Распространенным механизмом является избыточная экспрессия экспортеров ABC, таких как P-гликопротеин.(P-gp / ABCB1), белок 1, связанный с множественной лекарственной устойчивостью ( MRP1 / ABCC1 ), и белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP / ABCG2) в раковых клетках, которые ограничивают воздействие противоопухолевых препаратов. ^[63]

У грамотрицательных организмов переносчики ABC опосредуют секрецию белковых субстратов через внутреннюю и внешнюю мембраны одновременно, не проходя через периплазму. Этот тип секреции называется секрецией типа I , который включает три компонента, которые действуют согласованно: экспортер ABC , слитый с мембраной белок (MFP) и фактор внешней мембраны (OMF) . Примером является секреция гемолизина (HlyA) из E. coli, где ABC-переносчик HlyB внутренней мембраны взаимодействует с гибридным белком внутренней мембраны HlyD и фасилитатором внешней мембраны TolC. TolC позволяет гемолизину транспортироваться через две мембраны, минуя периплазму.^{[1] [62] [15]}

Устойчивость к бактериальным препаратам становится все более серьезной проблемой для здоровья. Один из механизмов устойчивости к лекарствам связан с увеличением оттока антибиотиков из бактериальной клетки. Устойчивость к лекарственным средствам, связанная с оттоком лекарств, опосредованная Р-гликопротеином , первоначально была обнаружена в клетках млекопитающих. В отношении бактерий Леви и его коллеги представили первое доказательство того, что устойчивость к антибиотикам была вызвана активным истечением лекарства. ^[64] P-гликопротеин является наиболее изученным оттоком насоса и, как таковой, дал важные сведения о механизме бактериальных насосов. ^[4] Хотя некоторые экспортеры транспортируют определенный тип субстрата, большинство транспортеров экструдируют разнообразные классы лекарств с разной структурой. ^[18] Эти транспортеры обычно называются транспортерами ABC с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и иногда называются «гидрофобными пылесосами». ^[54]

Человеческий ABCB1 / MDR1 P-гликопротеин [ править ]

Р-гликопротеин (3.A.1.201.1) - хорошо изученный белок, связанный с множественной лекарственной устойчивостью. Он принадлежит к семейству человеческих ABCB (MDR / TAP) и также известен как ABCB1 или MDR1 Pgp . MDR1 состоит из функционального мономера с двумя трансмембранными доменами (TMD) и двумя нуклеотид-связывающими доменами (NBD). Этот белок может транспортировать в основном катионные или электрически нейтральные субстраты, а также широкий спектр амфифильных субстратов. Структура полноразмерного мономера ABCB1 была получена в присутствии и в отсутствие нуклеотида с помощью электронной криокристаллографии.. Без нуклеотида TMD приблизительно параллельны и образуют цилиндр, окружающий центральную пору, с отверстием, обращенным к внеклеточной стороне мембраны, и закрытым на внутриклеточной поверхности. В присутствии негидролизуемого аналога АТФ, AMP-PNP, TMD имеют существенную реорганизацию с тремя четко разделенными доменами. Центральная пора, которая заключена между TMD, немного открыта по направлению к внутриклеточной поверхности с зазором между двумя доменами, обеспечивающим доступ субстрата из липидной фазы. Существенная переупаковка и возможное вращение спиралей TM при связывании нуклеотидов предполагает модель вращения спирали для транспортного механизма. ^[18]

Транспортеры растений [ править ]

Геном модельного растения Arabidopsis thaliana способен кодировать 120 белков ABC по сравнению с 50-70 белками ABC, которые кодируются геномом человека и плодовых мух ( Drosophila melanogaster ). Белки ABC растений подразделяются на 13 подсемейств на основе размера (полный, половина или четверть), ориентации и общего сходства аминокислотной последовательности. ^[65] Гомологи с множественной лекарственной устойчивостью (MDR), также известные как P-гликопротеины, представляют собой крупнейшее подсемейство растений с 22 членами и второе по величине подсемейство ABC в целом. Подсемейство B растительных переносчиков ABC (ABCB) характеризуется своей локализацией на плазматической мембране. ^[66] Растительные переносчики ABCB характеризуются гетерологичной экспрессией их вEscherichia coli , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe (делящиеся дрожжи) и клетки HeLa для определения субстратной специфичности. Растительные переносчики ABCB могут транспортировать фитогормон индол-3-уксусную кислоту (ИУК) ^[67], также известную как ауксин , важный регулятор роста и развития растений. ^{[68] [69]} Направленный полярный транспорт ауксина опосредует реакцию растений на окружающую среду посредством таких процессов, как фототропизм и гравитропизм. ^[70] Два из наиболее изученных переносчиков ауксина, ABCB1 и ABCB19, были охарактеризованы как первичные экспортеры ауксина ^[68]Другие переносчики ABCB, такие как ABCB4, участвуют как в экспорте, так и в импорте ауксина ^[68]. При низких внутриклеточных концентрациях ауксина ABCB4 импортирует ауксин до тех пор, пока не достигнет определенного порога, который затем меняет функцию на экспорт только ауксина. ^{[68] [71]}

Sav1866 [ править ]

Первой структурой с высоким разрешением, описанной для экспортера ABC, была структура Sav1866 (3.A.1.106.2) из Staphylococcus aureus . ^{[18] [72]} Sav1866 является гомологом переносчиков ABC с несколькими лекарствами. Он показывает значительное сходство последовательностей с человеческими переносчиками ABC подсемейства B, которое включает MDR1 и TAP1 / TAP2. Известно, что активность АТФазы Sav1866 стимулируется противораковыми препаратами, такими как доксорубицин , винбластин и др. ^[73]что предполагает сходную субстратную специфичность к Р-гликопротеину и, следовательно, возможный общий механизм транслокации субстрата. Sav1866 представляет собой гомодимер полутранспортеров, и каждая субъединица содержит N-концевой TMD с шестью спиралями и C-концевой NBD. NBD сходны по структуре с таковыми из других переносчиков ABC, в которых два сайта связывания АТФ образуются на границе димера между мотивом Walker A одного NBD и мотивом LSGGQ другого. ADP-связанная структура Sav1866 показывает NBDs в закрытом димере, а TM-спирали расщепляются на два «крыла», ориентированных к периплазме, образуя обращенную наружу конформацию. Каждое крыло состоит из спиралей TM1-2 из одной субъединицы и TM3-6 из другой субъединицы.Он содержит длинные внутриклеточные петли (ICL или ICD), соединяющие TMD, которые выходят за пределы липидного бислоя в цитоплазму и взаимодействуют с 8 = D. В то время как импортеры содержат короткую спираль сцепления, которая контактирует с одним NBD, Sav1866 имеет две внутриклеточные спирали сцепления, одна (ICL1) контактирует с NBD обеих субъединиц, а другая (ICL2) взаимодействует только с противоположной субъединицей NBD.^{[22] [25] [53]}

MsbA [ править ]

MsbA (3.A.1.106.1) является переносчиком ABC с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и, возможно, липидной флиппазой . Это АТФаза, которая транспортирует липид А , гидрофобную часть липополисахарида (ЛПС), сахаролипид на основе глюкозамина, который составляет внешний монослой наружных мембран большинства грамотрицательных бактерий. Липид A является эндотоксином, поэтому потеря MsbA из клеточной мембраны или мутации , нарушающие транспорт, приводят к накоплению липида A во внутренней клеточной мембране, что приводит к гибели клетки. Он является близким бактериальным гомологом Р-гликопротеина (Pgp) по гомологии белковой последовательности и имеет перекрывающуюся субстратную специфичность с транспортером MDR-ABC LmrA изLactococcus lactis . ^[74] MsbA из E. coli на 36% идентичен NH _2.-концевая половина человеческого MDR1, предполагая общий механизм транспорта амфифатических и гидрофобных субстратов. Ген MsbA кодирует полутранспортер, который содержит трансмембранный домен (TMD), слитый с нуклеотид-связывающим доменом (NBD). Он собран как гомодимер с общей молекулярной массой 129,2 кДа. MsbA содержит 6 TMD на периплазматической стороне, NBD, расположенный на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, и внутриклеточный домен (ICD), соединяющий TMD и NBD. Эта консервативная спираль, идущая от сегментов TMD в активный сайт NBD или рядом с ним, в значительной степени ответственна за перекрестные помехи между TMD и NBD. В частности, ICD1 служит консервативным стержнем, вокруг которого может вращаться NBD, что позволяет NBD диссоциировать и димеризоваться во время связывания и гидролиза АТФ. ^{[4] [15][18] [22] [43] [53] [54] [75]}

Ранее опубликованные (а теперь отозванные) рентгеновские структуры MsbA несовместимы с бактериальным гомологом Sav1866. ^{[76] [77]} Структуры были повторно исследованы и обнаружили ошибку в назначении руки, что привело к неправильным моделям MsbA. Недавно ошибки были исправлены, и появились сообщения о новых конструкциях. ^[40] Состояние покоя E. coli MsbA демонстрирует перевернутую V-образную форму с камерой, доступной внутри транспортера, что указывает на открытую, обращенную внутрь конформацию.. Контакты димеров сконцентрированы между внеклеточными петлями, и хотя NBD находятся на расстоянии ≈50 Å друг от друга, субъединицы обращены друг к другу. Расстояние между остатками в месте границы раздела димеров было подтверждено экспериментами по сшиванию ^[78] и исследованиями спектроскопии ЭПР . ^[79] Относительно большая камера позволяет ей вмещать большие головные группы, такие как присутствующие в липиде А. Значительные конформационные изменения необходимы для перемещения больших головных групп сахара через мембрану. Разница между двумя безнуклеотидными (апо) структурами заключается в повороте на ≈30 ° спиралей TM4 / TM5 относительно спиралей TM3 / TM6. В закрытом состоянии апо (от V. choleraeMsbA), NBD выровнены и, хотя и расположены ближе друг к другу, не образуют АТФ-сэндвич, а петли P противоположных мономеров расположены рядом друг с другом. По сравнению с открытой конформацией, интерфейс димеров TMD в закрытой, обращенной внутрь конформации имеет обширные контакты. Для обеих конформаций апо MsbA отверстие камеры обращено внутрь. По структуре MsbA-AMP-PNP (5'-аденилил-β-γ-имидодифосфат), полученный из S. typhimurium , аналогичен Sav1866. NBD в этой нуклеотид-связанной, обращенной наружу конформации, собираются вместе, образуя канонический сэндвич с димером АТФ, то есть нуклеотид расположен между P-петлей и мотивом LSGGQ. Конформационный переход от MsbA-closed-apo к MsbA-AMP-PNP включает два этапа, которые, скорее всего, согласованы: поворот на ≈10 ° спиралей TM4 / TM5 к TM3 / TM6, сближая NBD, но не в выравнивание, за которым следует наклон спиралей TM4 / TM5 ≈20 ° из плоскости. Скручивающее движение приводит к отделению спиралей TM3 / TM6 от TM1 / TM2, что приводит к изменению конформации от внутренней к обращенной наружу. Таким образом, изменения как ориентации, так и расстояния между NBD резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно переключают доступ к камере с внутреннего на внешний листок мембраны. ^[40]Конструкции, определенные для MsbA, являются основой для наклонной модели транспорта. ^[18] Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, что также подтверждается исследованиями флуоресценции и ЭПР. ^{[53] [79] [80]} Недавняя работа привела к открытию ингибиторов MsbA. ^{[81] [82]}

Транспортный механизм для экспортеров [ править ]

У экспортеров ABC есть транспортный механизм, совместимый как с моделью переменного доступа, так и с моделью ATP-switch. В апо-состояниях экспортеров конформация обращена внутрь, а TMD и NBD расположены относительно далеко друг от друга для размещения амфифильных или гидрофобных субстратов. Для MsbA, в частности, размер камеры достаточно велик для размещения сахарных групп липополисахаридов (LPS). Как было предположено несколькими группами, связывание субстрата инициирует транспортный цикл. «Силовой удар», то есть связывание АТФ, которое индуцирует димеризацию NBD и образование сэндвича АТФ, управляет конформационными изменениями в TMD. В MsbA группы сахарных головок изолируются внутри камеры во время «рабочего хода».Полость выстлана заряженными и полярными остатками, которые, вероятно, сольватированы, создавая энергетически неблагоприятную среду для гидрофобных субстратов и энергетически благоприятную для полярных фрагментов в амфифильных соединениях или сахарных группах из LPS. Поскольку липид не может быть стабильным в течение длительного времени в окружающей среде камеры, липид А и другие гидрофобные молекулы могут «перевернуться» в энергетически более выгодное положение внутри листочка внешней мембраны. «Переворот» также может быть вызван сдвигом твердого тела TMD, в то время как гидрофобные хвосты LPS протаскиваются через липидный бислой. Повторная упаковка спиралей переводит конформацию во внешнее состояние. Гидролиз АТФ может расширять периплазматическое отверстие и подталкивать субстрат к внешнему листку липидного бислоя.Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение P_Я разделяет NBD с последующим восстановлением состояния покоя, открывая камеру по направлению к цитоплазме для другого цикла. ^{[40] [43] [51] [54] [76] [77] [79] [83]}

Роль в множественной лекарственной устойчивости [ править ]

Известно, что переносчики ABC играют решающую роль в развитии множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). При МЛУ у пациентов, которые принимают лекарства, в конечном итоге развивается устойчивость не только к лекарству, которое они принимают, но и к нескольким различным типам лекарств. Это вызвано несколькими факторами, одним из которых является усиленное изгнание лекарства из клетки переносчиками ABC. Например, белок ABCB1 ( Р-гликопротеин) выполняет функцию выкачивания лекарств, подавляющих опухоль, из клетки. Pgp, также называемый MDR1, ABCB1, является прототипом переносчиков ABC, а также наиболее изученным геном. Известно, что Pgp переносит органические катионные или нейтральные соединения. Было продемонстрировано, что несколько членов семейства ABCC, также известных как MRP, придают MDR органическим анионным соединениям. Наиболее изученным членом семейства ABCG является ABCG2, также известный как BCRP (белок устойчивости к раку груди), придающий устойчивость к большинству ингибиторов топоизомеразы I или II, таких как топотекан, иринотекан и доксорубицин.

Неясно, как именно эти белки могут перемещать такое большое количество лекарств, однако одна модель (модель гидрофобного пылесоса) утверждает, что в P-гликопротеине лекарства связываются без разбора из липидной фазы на основе их гидрофобности.

Открытие первого эукариотического белка-переносчика ABC произошло в результате исследований опухолевых клеток и культивируемых клеток, которые проявляли устойчивость к нескольким лекарствам с несвязанными химическими структурами. Было показано, что эти клетки экспрессируют повышенные уровни транспортного белка с множественной лекарственной устойчивостью (MDR), который первоначально назывался P-гликопротеином (P-gp), но его также называют белком 1 множественной лекарственной устойчивости (MDR1) или ABCB1. Этот белок использует гидролиз АТФ., как и другие переносчики ABC, экспортировать большое количество различных лекарств из цитозоля во внеклеточную среду. В клетках с множественной лекарственной устойчивостью ген MDR1 часто амплифицируется. Это приводит к большому перепроизводству белка MDR1. Субстраты ABCB1 млекопитающих в основном представляют собой плоские липидорастворимые молекулы с одним или несколькими положительными зарядами. Все эти субстраты конкурируют друг с другом за транспорт, предполагая, что они связываются с одними и теми же или перекрывающимися сайтами на белке. Многие лекарства, которые переносятся ABCB1, представляют собой небольшие неполярные лекарства, которые диффундируют через внеклеточную среду в цитозоль, где они блокируют различные клеточные функции. Такие препараты, как колхицин и винбластин., которые блокируют сборку микротрубочек, свободно проникают через мембрану в цитозоль, но экспорт этих препаратов посредством ABCB1 снижает их концентрацию в клетке. Следовательно, для уничтожения клеток, экспрессирующих ABCB1, требуется более высокая концентрация лекарств, чем тех, которые не экспрессируют ген. ^[10]

Другими переносчиками ABC, которые вносят вклад в множественную лекарственную устойчивость, являются ABCC1 (MRP1) и ABCG2 (белок устойчивости к раку груди). ^[84]

Чтобы решить проблемы, связанные с множественной лекарственной устойчивостью MDR1, можно использовать различные типы лекарств или подавить сами переносчики ABC. Чтобы другие типы лекарств работали, они должны обходить механизм резистентности, который является переносчиком ABC . Для этого можно использовать другие противоопухолевые препараты, такие как алкилирующие препараты ( циклофосфамид ), антиметаболиты ( 5-фторурацил ) и препараты, модифицированные антрациклином ( аннамицин и доксорубицин- пептид). Эти препараты не могут служить субстратомтранспортеров ABC, и поэтому не будут транспортироваться. Другой вариант - одновременное использование комбинации препаратов, ингибирующих ABC, и противоопухолевых препаратов. Это изменило бы устойчивость к противоопухолевым препаратам, чтобы они могли функционировать должным образом. Субстраты, которые изменяют устойчивость к противоопухолевым препаратам, называются хемосенсибилизаторами. ^[8]

Отмена множественной лекарственной устойчивости [ править ]

Устойчивость к лекарствам - обычная клиническая проблема, которая возникает у пациентов, страдающих инфекционными заболеваниями, и у пациентов, страдающих раком. Прокариотические и эукариотические микроорганизмы, а также неопластические клетки часто оказываются устойчивыми к лекарствам. МЛУ часто ассоциируется со сверхэкспрессией транспортеров ABC. Ингибирование переносчиков ABC низкомолекулярными соединениями широко исследовалось у онкологических больных; Однако клинические результаты неутешительны. В последнее время различные РНКибыли применены стратегии для реверсирования МЛУ в различных моделях опухолей, и эта технология эффективна в обращении МЛУ, опосредованной ABC-переносчиком, в раковых клетках и, следовательно, является многообещающей стратегией преодоления МЛУ с помощью генных терапевтических применений. Технология RNAi также может быть рассмотрена для преодоления МЛУ при инфекционных заболеваниях, вызываемых микробными патогенами. ^[85]

Физиологическая роль [ править ]

Помимо передачи МЛУ в опухолевых клетках, переносчики ABC также экспрессируются в мембранах здоровых клеток, где они способствуют транспортировке различных эндогенных веществ, а также веществ, чужеродных для организма. Например, переносчики ABC, такие как Pgp, MRP и BCRP, ограничивают всасывание многих лекарств из кишечника и перекачивают лекарства из клеток печени в желчь ^[86] как средство удаления инородных веществ из организма. Большое количество лекарств либо транспортируется самими транспортными средствами ABC, либо влияет на транспортировку других лекарств. Последний сценарий может привести к лекарственным взаимодействиям , ^[87] иногда приводит к измененным эффектам лекарств. ^[88]

Методы описания взаимодействий ABC-транспортеров [ править ]

Существует ряд типов анализов, которые позволяют обнаруживать взаимодействия переносчика ABC с эндогенными и ксенобиотическими соединениями. ^[89] Сложность анализа варьируется от относительно простых мембранных анализов. ^[90] как анализ везикулярного транспорта, анализ АТФазы до более сложных анализов на основе клеток, вплоть до сложных in vivo Джеффри П., Саммерфилд С.Г. (2007). «Проблемы скрининга гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)». Xenobiotica . 37 (10–11): 1135–51. DOI : 10.1080 / 00498250701570285 . PMID  17968740 . S2CID  25944548 .методики обнаружения. ^[91]

Мембранные анализы [ править ]

Анализ везикулярного транспорта обнаруживает перемещение молекул переносчиками ABC. ^[92]Мембраны, полученные в подходящих условиях, содержат везикулы, ориентированные наизнанку, причем сайт связывания АТФ и сайт связывания субстрата переносчика обращены к буферу снаружи. Субстраты переносчика захватываются везикулами АТФ-зависимым образом. Для отделения везикул от инкубационного раствора используется быстрая фильтрация с использованием стекловолоконных фильтров или нитроцеллюлозных мембран, и тестируемое соединение, захваченное внутри везикул, остается на фильтре. Количество транспортируемых немеченых молекул определяют с помощью ВЭЖХ, ЖХ / МС, ЖХ / МС / МС. Альтернативно, соединения имеют радиоактивную метку, флуоресцентные или имеют флуоресцентную метку, так что радиоактивность или флуоресценция, сохраняющаяся на фильтре, может быть определена количественно.

В исследованиях везикулярного транспорта используются различные типы мембран из разных источников (например, клетки насекомых, трансфицированные или выбранные клеточные линии млекопитающих). Мембраны коммерчески доступны или могут быть получены из различных клеток или даже тканей, например мембран канальцев печени. Этот тип анализа имеет то преимущество, что измеряет фактическое расположение субстрата на клеточной мембране. Его недостаток состоит в том, что соединения со средней и высокой пассивной проницаемостью не удерживаются внутри пузырьков, что затрудняет выполнение прямых измерений переноса с этим классом соединений.

Анализ везикулярного транспорта можно проводить в «непрямых» условиях, когда взаимодействующие тестируемые лекарственные средства модулируют скорость транспорта репортерного соединения. Этот тип анализа особенно подходит для обнаружения возможных взаимодействий лекарственное средство-лекарственное средство и взаимодействий лекарственное средство-эндогенный субстрат. Он не чувствителен к пассивной проницаемости соединений и поэтому обнаруживает все взаимодействующие соединения. Тем не менее, он не дает информации о том, является ли тестируемое соединение ингибитором переносчика или субстратом переносчика, ингибирующим его функцию конкурентным образом. Типичным примером непрямого анализа везикулярного транспорта является обнаружение ингибирования транспорта таурохолатов с помощью ABCB11 ( BSEP ).

Анализы на основе целых клеток [ править ]

Клетки, экспрессирующие переносчик оттока, активно откачивают субстраты из клетки, что приводит к более низкой скорости накопления субстрата, более низкой внутриклеточной концентрации в устойчивом состоянии или более высокой скорости выведения субстрата из клеток, загруженных субстратом. Переносимые радиоактивные субстраты или меченые флуоресцентные красители могут быть измерены напрямую, или при непрямой настройке модуляция накопления зондового субстрата (например, флуоресцентных красителей, таких как родамин 123 или кальцеин) может быть определена в присутствии исследуемого лекарства. ^[87]

Кальцеин-AM, производное кальцеина с высокой проницаемостьюлегко проникает в интактные клетки, где эндогенные эстеразы быстро гидролизуют его до флуоресцентного кальцеина. В отличие от кальцеина-АМ, кальцеин имеет низкую проницаемость и поэтому задерживается в клетке и накапливается. Поскольку кальцеин-AM является отличным субстратом для переносчиков оттока MDR1 и MRP1, клетки, экспрессирующие переносчики MDR1 и / или MRP1, выкачивают кальцеин-AM из клетки до того, как эстеразы смогут его гидролизовать. Это приводит к снижению скорости накопления кальцеина в клетках. Чем выше активность МЛУ в клеточной мембране, тем меньше кальцеина накапливается в цитоплазме. В клетках, экспрессирующих МЛУ, добавление в избытке ингибитора МЛУ или субстрата МЛУ резко увеличивает скорость накопления кальцеина.Активность переносчика нескольких лекарственных средств отражается разницей между количествами красителя, накопленного в присутствии и в отсутствие ингибитора. Используя селективные ингибиторы, можно легко различить транспортную активность MDR1 и MRP1. Этот анализ можно использовать для скрининга лекарств на предмет взаимодействия с переносчиками, а также для количественной оценки MDR-активности клеток. Анализ кальцеина - это патентованный анализ компании SOLVO Biotechnology.

Подсемейства [ править ]

Подсемейства млекопитающих [ править ]

Существует 49 известных переносчиков ABC, присутствующих в организме человека, которые классифицируются на семь семейств Human Genome Organization.

Полный список переносчиков ABC человека можно найти здесь. ^[93]

ABCA [ править ]

Подсемейство ABCA состоит из 12 полных транспортеров, разделенных на две подгруппы. Первая подгруппа состоит из семи генов, которые соответствуют шести различным хромосомам . Это ABCA1 , ABCA2 , ABCA3 и abca4 , ABCA7 , ABCA12 и abca13 . Другая подгруппа состоит из ABCA5 и ABCA6 и ABCA8 , ABCA9 и ABCA10 . A8-10. Вся подгруппа 2 организована в кластер хромосом от головы к хвосту на хромосоме 17q.24. Гены этой второй подгруппы отличаются от ABCA1-подобных генов наличием 37–38 экзонов по сравнению с 50 экзонами в ABCA1. Подгруппа ABCA1 участвует в развитии генетических заболеваний. При рецессивной болезни Танжера происходит мутация белка ABCA1 . Кроме того, ABCA4 отображается на область хромосомы 1p21, которая содержит ген болезни Штаргардта. Было обнаружено, что этот ген сильно экспрессируется в фоторецепторах палочек и мутирован при болезни Штаргардта, пигментации рецессивного ретинита и в большинстве случаев рецессивной дистрофии колбочек-палочек. ^[9]

ABCB [ править ]

Подсемейство ABCB состоит из четырех полных транспортеров и двух полутранспортеров. Это единственное подсемейство людей, которое имеет как половинные, так и полные типы переносчиков. ABCB1 был обнаружен как белок, сверхэкспрессируемый в некоторых опухолевых клетках, устойчивых к лекарствам. Он экспрессируется в основном через гематоэнцефалический барьер и печень и, как полагают, участвует в защите клеток от токсинов. Клетки, которые сверхэкспрессируют этот белок, обладают множественной лекарственной устойчивостью . ^[9]

ABCC [ править ]

Подсемейство ABCC состоит из тринадцати членов, девять из которых называются белками множественной лекарственной устойчивости (MRP). Белки MRP встречаются в природе и выполняют множество важных функций. ^[94] Известно, что они участвуют в транспорте ионов, секреции токсинов и передаче сигналов. ^[9] Из девяти белков MRP четыре из них, MRP4, 5, 8, 9 (ABCC4, 5, 11 и 12), имеют типичную структуру ABC с четырьмя доменами, включающими два домена, перекрывающих мембрану, каждый из которых охватывает домен, за которым следует домен связывания нуклеотидов. Они называются короткими MRP. Остальные 5 MRP (MRP1, 2, 6, 7 (ABCC1, 2, 3, 6 и 10) известны как длинные MRP и содержат дополнительный пятый домен на своем N-конце. ^[94]

CFTR , переносчик, участвующий в заболевании кистозным фиброзом , также считается частью этого подсемейства. Муковисцидоз возникает при мутации и потере функции CFTR. ^[9]

Эти сульфонилмочевины рецепторы (SUR) , участвующие в секреции инсулина, нейрональной функции и функции мышц, также являются частью этого семейства белков. Мутации в белках SUR являются потенциальной причиной сахарного диабета у новорожденных . SUR также является участком связывания лекарственных средств, таких как сульфонилмочевина, и активаторов, открывающих калиевые каналы, таких как диазоксид .

ABCD [ править ]

Подсемейство ABCD состоит из четырех генов, которые кодируют половинные транспортеры, экспрессируемые исключительно в пероксисоме . ABCD1 отвечает за X-сцепленную форму адренолейкодистрофии (ALD), которая представляет собой заболевание, характеризующееся нейродегенерацией и недостаточностью надпочечников, которая обычно начинается в позднем детстве. В клетках пациентов с ALD происходит накопление неразветвленных насыщенных жирных кислот, но точная роль ABCD1 в этом процессе все еще не определена. Кроме того, функция других генов ABCD еще не определена, но считается, что они оказывают родственные функции в метаболизме жирных кислот . ^[9]

ABCE и ABCF [ править ]

Обе эти подгруппы состоят из генов, которые имеют домены связывания АТФ, которые тесно связаны с другими переносчиками ABC, но эти гены не кодируют трансмембранные домены. ABCE состоит только из одного члена, OABP или ABCE1 , который, как известно, распознает определенные олигодендроциты, образующиеся в ответ на определенные вирусные инфекции. Каждый член подгруппы ABCF состоит из пары связывающих АТФ доменов. ^[9]

ABCG [ править ]

Шесть полутранспортеров с сайтами связывания АТФ на N-конце и трансмембранными доменами на C-конце составляют подсемейство ABCG. Эта ориентация противоположна всем другим генам ABC. В геноме человека всего 5 генов ABCG, но 15 - в геноме дрозофилы и 10 - в дрожжах. Ген ABCG2 был обнаружен в линиях клеток, отобранных с учетом высокого уровня устойчивости к митоксантрону и отсутствия экспрессии ABCB1 или ABCC1 . ABCG2 может экспортировать антроциклиновые противоопухолевые препараты, а также топотекан , митоксантрон или доксорубицин в качестве субстратов. Хромосомные транслокациибыло обнаружено, что они вызывают амплификацию или перестройку ABCG2, обнаруженную в устойчивых клеточных линиях. Нормальная функция ABCG2 неизвестна. ^[9]

Межвидовые подсемейства [ править ]

Следующая система классификации трансмембранных переносчиков растворенных веществ была построена в TCDB. ^[95]

Три семейства экспортеров ABC определяются их эволюционным происхождением. ^[6] Экспортеры ABC1 эволюционировали путем внутригенного трипликации предшественника 2 TMS (TMS = трансмембранный сегмент. Белок «2 TMS» имеет 2 трансмембранных сегмента) с образованием 6 белков TMS. Экспортеры ABC2 эволюционировали путем внутригенного дублирования предшественника 3 TMS, а экспортеры ABC3 произошли от предшественника 4 TMS, который дублировался либо экстрагенно, чтобы дать два белка 4 TMS, оба требуемые для транспортной функции, либо внутригенно, чтобы дать 8 или 10 белков TMS. 10 белков TMS, по-видимому, имеют два дополнительных TMS между двумя 4 повторяющимися единицами TMS. ^[96]Большинство систем захвата (все, кроме 3.A.1.21) относятся к типу ABC2, разделенному на тип I и тип II по способу обращения с нуклеотидами. Особое подсемейство импортеров ABC2, называемое ECF, использует отдельную субъединицу для распознавания субстрата. ^[97]

ABC1 ( InterPro :  IPR036640 ):

ABC2 ( InterPro :  IPR000412 [частично]):

ABC3 ( InterPro :  IPR003838 ):

Посмотреть белки, принадлежащие к суперсемейству ABC: здесь

Изображения [ править ]

В последние годы были созданы многие структуры водорастворимых доменов белков ABC. ^[2]

См. Также [ править ]

• АТФ-связывающий домен транспортеров ABC
• Трансмембранный домен транспортеров ABC

Ссылки [ править ]

Дальнейшее чтение [ править ]

Внешние ссылки [ править ]

• Классификация ABC-транспортеров в TCDB
• ABCdb База данных архей и бактерий ABC Systems, ABCdb
• АТФ-связывание + кассета + транспортеры в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)