Эксперимент Avery-Маклеода-Маккарти была экспериментальная демонстрация, сообщила в 1944 году Освальд Авери , Колин Маклеод и Маклин Маккарти , что ДНК является веществом , которое вызывает бактериальное превращение , в эпоху , когда оно было широко распространено мнение , что это белки , которые выполнял функцию переноса генетической информации (само слово « белок » было придумано для обозначения убеждения, что его функция была первичной ). Это было кульминацией исследований 1930-х и начала 20-го века в Институте медицинских исследований Рокфеллера.чтобы очистить и характеризовать «трансформирующий принцип» ответственного за явление трансформации , впервые описанным в эксперименте Гриффита 1928: погибли пневмококк из вирулентного штамма III-S, при введении вместе с живыми , но не вирулентного типа II-R пневмококков, в результате при смертельной инфекции пневмококками III-S типа. В своей статье « Исследования химической природы вещества, вызывающего трансформацию типов пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III », опубликованной в февральском выпуске журнала экспериментальной медицины за 1944 год , Эйвери и его коллеги предполагают, что ДНК, а не белок, как широко считалось в то время, может быть наследственным материалом бактерий и может быть аналогом генов и / или вирусов у высших организмов. [1] [2]
С развитием серологического типирования исследователи-медики смогли разделить бактерии на разные штаммы или типы . Когда человеку или подопытному животному (например, мыши ) прививают определенный тип, возникает иммунный ответ , генерирующий антитела, которые специфически реагируют с антигенами бактерий. Затем можно выделить сыворотку крови, содержащую антитела, и применить ее к культивированным бактериям . Антитела будут реагировать с другими бактериями того же типа, что и исходная инокуляция. Фред Нойфельд , немецкий бактериолог, открыл типы пневмококков и их серологическое типирование; до исследований Фредерика Гриффита бактериологи считали, что типы постоянны и неизменны от поколения к поколению. [3]
Эксперимент Гриффита , опубликованный в 1928 году, [4] выявил, что некий «трансформирующий принцип» в пневмококковых бактериях может трансформировать их из одного типа в другой. Гриффит, британский медицинский работник, провел годы, применяя серологическое типирование к случаям пневмонии , часто смертельной болезни в начале 20 века. Он обнаружил, что несколько типов - некоторые вирулентные, а некоторые невирулентные - часто присутствовали в течение клинического случая пневмонии, и полагал, что один тип может измениться на другой (а не просто несколько типов, присутствующих все время). Проверяя эту возможность, он обнаружил, что трансформация может происходить, когда мертвые бактерии вирулентного типа и живые бактерии невирулентного типа вводятся мышам: у мышей развивается смертельная инфекция (обычно вызываемая только живыми бактериями вирулентного типа). type) и погибают, а вирулентные бактерии могут быть изолированы от таких инфицированных мышей. [5]
Результаты эксперимента Гриффита вскоре были подтверждены, сначала Фредом Нойфельдом [6] из Института Коха и Мартином Генри Доусоном из Института Рокфеллера. [7] Ряд исследователей Института Рокфеллера продолжили изучение трансформации в последующие годы. Вместе с Ричардом Х.П. Сиа Доусон разработал метод трансформации бактерий in vitro (а не in vivo, как это сделал Гриффит). [8] После отъезда Доусона в 1930 году Джеймс Аллоуэй предпринял попытку расширить открытия Гриффита, что привело к экстракции водных растворов принципа трансформации к 1933 году. Колин МакЛауд работал над очисткой таких растворов с 1934 по 1937 год, и эта работа была продолжение в 1940 году и завершено Маклин Маккарти. [9] [10]
Экспериментальная работа
Пневмококк характеризуется гладкими колониями с полисахаридной капсулой, индуцирующей образование антител ; различные типы классифицируются в соответствии с их иммунологической специфичностью. [1]
Процедура очистки, которую предпринял Эйвери, заключалась в уничтожении бактерий при нагревании и извлечении компонентов, растворимых в физиологическом растворе. Затем белки осаждают с использованием хлороформа и полисахаридные капсулы гидролизуют с ферментом . Иммунологическое осаждение, вызванное типоспецифическими антителами, использовали для проверки полного разрушения капсул. Затем активную часть осаждали спиртовым фракционированием , в результате чего получали волокнистые нити, которые можно было удалить с помощью палочки для перемешивания. [1]
Химический анализ показал, что пропорции углерода, водорода, азота и фосфора в этой активной части соответствовали химическому составу ДНК. Чтобы показать, что за трансформацию отвечает ДНК, а не небольшое количество РНК , белка или какого-либо другого клеточного компонента, Эйвери и его коллеги использовали ряд биохимических тестов. Они обнаружили, что трипсин , химотрипсин и рибонуклеаза (ферменты, расщепляющие белки или РНК) не влияли на него, но ферментный препарат «дезоксирибонуклеодеполимераза» (неочищенный препарат, получаемый из ряда животных источников, который мог разрушать ДНК) разрушал трансформирующая сила экстракта. [1]
Последующая работа в ответ на критику и вызовы включала очистку и кристаллизацию Мозесом Куницем в 1948 году ДНК-деполимеразы ( дезоксирибонуклеаза I ) и точную работу Роллина Хотчкисса, показавшую, что практически весь обнаруженный азот в очищенной ДНК происходил из глицин , продукт распада нуклеотидного основания аденина , и это необнаруженное белковое загрязнение, по оценке Хотчкисса, составило не более 0,02%. [11] [12]
Экспериментальные данные эксперимента Эйвери-МакЛеода-Маккарти были быстро подтверждены и распространены на другие наследственные характеристики помимо полисахаридных капсул. Однако было значительное нежелание принять вывод о том, что ДНК является генетическим материалом. Согласно Феб Левена «s влиятельный„ тетрануклеотида гипотезы “ДНК состоит из повторяющихся звеньев четырех нуклеотидных оснований и мало биологической специфичностью. Поэтому считалось, что ДНК является структурным компонентом хромосом , в то время как гены, вероятно, состоят из белкового компонента хромосом. [13] [14] Эта линия мышления была подкреплена 1935 кристаллизацией вируса мозаики табака по Уэнделлу Stanley , [15] и параллели среди вирусов, генов и ферментов; многие биологи думали, что гены могут быть своего рода «суперферментом», а вирусы, согласно Стэнли, были белками и обладают свойством автокатализа, присущим многим ферментам. [16] Кроме того, немногие биологи думали, что генетика может быть применена к бактериям, поскольку у них отсутствовали хромосомы и половое размножение . В частности, многие генетики, неофициально известные как группа фагов , которая станет влиятельной в новой дисциплине молекулярной биологии в 1950-х годах, пренебрегали ДНК как генетическим материалом (и были склонны избегать «беспорядочных» биохимических подходов Эйвери и его коллеги). Некоторые биологи, в том числе научный сотрудник Института Рокфеллера Альфред Мирски , оспаривали открытие Эйвери о том, что принцип трансформации - это чистая ДНК, предполагая, что вместо этого виноваты белковые примеси. [13] [14] Хотя трансформация произошла в некоторых типах бактерий, она не могла быть воспроизведена в других бактериях (ни в каких высших организмах), и ее значение, казалось, ограничивалось прежде всего медициной. [13] [17]
Ученые, оглядываясь назад на эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти, расходятся во мнениях относительно его влияния в 1940-х и начале 1950-х годов. Гюнтер Стент предположил, что это в значительной степени игнорировалось и отмечалось только впоследствии - подобно работе Грегора Менделя за десятилетия до появления генетики . Другие, такие как Джошуа Ледерберг и Лесли С. Данн , подтверждают его раннее значение и называют эксперимент началом молекулярной генетики . [18]
Несколько микробиологов и генетиков интересовались физической и химической природой генов до 1944 года, но эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти вновь и вновь вызвал интерес к этой теме. Хотя в оригинальной публикации генетика конкретно не упоминалась, Эйвери, а также многие генетики, читавшие статью, знали о генетических последствиях - что Эйвери, возможно, выделил сам ген как чистую ДНК. Биохимик Эрвин Чаргафф , генетик Х. Дж. Мюллер и другие высоко оценили результат как установление биологической специфичности ДНК и важные последствия для генетики, если ДНК играла аналогичную роль в высших организмах. В 1945 году Королевское общество наградило Эйвери медалью Копли , в частности, за его работу по бактериальной трансформации. [19]
В период с 1944 по 1954 год статья цитировалась не менее 239 раз (причем количество цитирований в эти годы распределялось равномерно), в основном в статьях по микробиологии, иммунохимии и биохимии. В дополнение к продолжению работы Маккарти и других сотрудников Института Рокфеллера в ответ на критику Мирского, эксперимент стимулировал значительную работу в области микробиологии, где он пролил новый свет на аналогии между наследственностью бактерий и генетикой организмов, размножающихся половым путем. [17] Французский микробиолог Андре Boivin утверждал продлить бактериальные результаты трансформации Avery для кишечной палочки , [20] , хотя это не может быть подтверждено другими исследователями. [17] Однако в 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдвард Татум продемонстрировали бактериальную конъюгацию в E. coli и показали, что генетика может применяться к бактериям, даже если конкретный метод трансформации Эйвери не был общим. [21] Работа Эйвери также побудила Мориса Уилкинса продолжить рентгеновские кристаллографические исследования ДНК, даже несмотря на то, что он столкнулся с давлением со стороны спонсоров, чтобы сосредоточить свои исследования на целых клетках, а не на биомолекулах. [17]
Несмотря на значительное количество цитирований статьи и положительные отзывы, полученные в последующие годы после публикации, работа Эйвери в значительной степени игнорировалась научным сообществом. Хотя многие ученые положительно восприняли этот эксперимент, он не оказал серьезного воздействия на основные генетические исследования, отчасти потому, что он не имел большого значения для классических генетических экспериментов, в которых гены определялись их поведением в экспериментах по разведению, а не их химическим составом. Х. Дж. Мюллер, хотя и был заинтересован, был сосредоточен больше на физических, а не на химических исследованиях гена, как и большинство членов группы фагов . Нобелевский фонд не уделял внимания работе Эйвери , который позже выразил публичное сожаление по поводу того, что не смог присуждать Эйвери Нобелевскую премию . [22]
Ко времени эксперимента Херши-Чейза в 1952 году генетики были более склонны рассматривать ДНК как генетический материал, и Альфред Херши был влиятельным членом группы фагов. [23] [24] Эрвин Чаргафф показал, что основной состав ДНК варьируется в зависимости от вида (вопреки гипотезе о тетрануклеотидах), [25] и в 1952 году Роллин Хотчкисс опубликовал свои экспериментальные данные, подтверждающие работу Чаргаффа и демонстрирующие отсутствие белка в Принцип преобразования Эйвери. [26] Более того, область бактериальной генетики быстро утвердилась, и биологи были более склонны думать о наследственности в тех же терминах, что и бактерии, и высшие организмы. [23] [24] После того, как Херши и Чейз использовали радиоактивные изотопы , чтобы показать , что это было главным образом ДНК, а не белок, которые вошли бактерии при инфекции с бактериофагом , [27] она вскоре была широко признано , что ДНК материал. Несмотря на гораздо менее точные экспериментальные результаты (они обнаружили немаловажное количество белка, поступающего в клетки, а также ДНК), эксперимент Херши-Чейза не подвергался такой же степени сложности. Его влияние было усилено растущей сетью группы фагов, а в следующем году - известностью вокруг структуры ДНК, предложенной Уотсоном и Криком (Уотсон также был членом группы фагов). Однако только ретроспективно оба эксперимента окончательно доказали, что ДНК является генетическим материалом. [23] [24]
Заметки
- ^ a b c d Эйвери, Освальд Т .; Колин М. Маклауд; Маклин Маккарти (1944-02-01). «Исследования химической природы вещества, вызывающего трансформацию пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III» . Журнал экспериментальной медицины . 79 (2): 137–158. DOI : 10,1084 / jem.79.2.137 . PMC 2135445 . PMID 19871359 .
- ^ Fruton (1999), стр. 438-440
- ^ Лерер, Стивен. Исследователи тела. 2-е издание. iuniverse 2006, стр. 46 [1]
- ^ Гриффит, Фредерик (январь 1928 г.). «Значение типов пневмококков» . Журнал гигиены . 27 (2): 113–159. DOI : 10.1017 / S0022172400031879 . JSTOR 4626734 . PMC 2167760 . PMID 20474956 .
- ^ Доус, Хизер (август 2004 г.). «Тихая революция» . Текущая биология . 14 (15): R605 – R607. DOI : 10.1016 / j.cub.2004.07.038 . PMID 15296771 .
- ^ Нойфельд, Фред; Левинталь, Вальтер (1928). "Beitrage zur Variabilitat der Pneumokokken" . Zeitschrift für Immunitatsforschung . 55 : 324–340.
- ^ Доусон, Мартин Х. « Взаимопревращаемость R- и S-форм пневмококка », Журнал экспериментальной медицины , том 47, вып. 4 (1 апреля 1928 г.): 577–591.
- ^ Dawson, Martin H .; Сиа, Ричард HP (1930). «Трансформация типов пневмококков in vitro» . Труды Общества экспериментальной биологии и медицины . 27 (9): 989–990. DOI : 10.3181 / 00379727-27-5078 .
- ^ Fruton (1999), стр. 438
- ↑ Коллекция Освальда Т. Эйвери: « Смещение фокуса: ранняя работа по бактериальной трансформации, 1928–1940 ». Профили в науке . Национальная медицинская библиотека США. Доступ 25 февраля 2009 г.
- ^ Fruton (1999), стр. 439
- ^ Виткин Е.М. (август 2005 г.). «Вспоминая Роллина Гочкиса (1911–2004)» . Генетика . 170 (4): 1443–7. PMC 1449782 . PMID 16144981 .
- ^ a b c Morange (1998), стр. 30–39
- ^ a b Fruton (1999), стр. 440–441
- ^ Стэнли, Венделл М. (1935-06-28). «Выделение кристаллического белка, обладающего свойствами вируса табачной мозаики» (PDF) . Наука . Новая серия. 81 (2113): 644–645. Bibcode : 1935Sci .... 81..644S . DOI : 10.1126 / science.81.2113.644 . JSTOR 1658941 . PMID 17743301 . Архивировано из оригинального (PDF) 27 сентября 2006 года . Проверено 26 февраля 2009 .
- ^ О пересекающихся теориях вирусов, генов и ферментов в этот период см. Creager, Angela NH . Жизнь вируса: вирус табачной мозаики как экспериментальная модель, 1930–1965 . Издательство Чикагского университета: Чикаго, 2002. ISBN 0-226-12025-2
- ^ a b c d Deichmann, стр. 220–222.
- ^ Дайхманн, стр. 207-209
- ^ Дайхманн, стр. 215-220
- ^ Бойвин; Буавен, Андре; Вендрели, Роджер; Лехоулт, Ивонн (1945). "L'acide thymonucléique hautement polyise, принцип действия кондиционера для специальной sériologique и ферментативного оборудования для бактеризации. Последствия для биохимии de l'hérédité". Comptes Rendus . 221 : 646–648.
- ^ Ледерберг, Джошуа; Эдвард Л. Татум (1946-10-19). «Рекомбинация генов в Escherichia Coli ». Природа . 158 (4016): 558. Bibcode : 1946Natur.158..558L . DOI : 10.1038 / 158558a0 . PMID 21001945 .
- ^ Дайхманн, стр. 227-231
- ^ a b c Morange (1998), стр. 44–50.
- ^ a b c Fruton (1999), стр. 440–442
- ^ Чаргафф Э. (июнь 1950 г.). «Химическая специфичность нуклеиновых кислот и механизм их ферментативной деградации». Experientia . 6 (6): 201–9. DOI : 10.1007 / BF02173653 . PMID 15421335 .
- ^ Хотчкисс, Роланд Д. "Роль дезоксирибонуклеотидов в бактериальных трансформациях". В WD McElroy; Б. Гласс (ред.). Метаболизм фосфора . Балтимор: Издательство Университета Джона Хопкинса. С. 426–36.
- ^ Херши А.Д., Чейз М. (май 1952 г.). «Независимые функции вирусного белка и нуклеиновой кислоты в росте бактериофага» . Журнал общей физиологии . 36 (1): 39–56. DOI : 10,1085 / jgp.36.1.39 . PMC 2147348 . PMID 12981234 .
Рекомендации
- Дайхманн, UTE (2004). «Ранние ответы на статью Эйвери и др. О ДНК как наследственном материале». Исторические исследования в физических и биологических науках . 34 (2): 207–32. DOI : 10.1525 / hsps.2004.34.2.207 .
- Фрутон, Джозеф С. (1999). Белки, ферменты, гены: взаимодействие химии и биологии . Нью-Хейвен, Коннектикут: Издательство Йельского университета. ISBN 978-0-300-07608-0.
- Кобб, Мэтью ; Моранж, Мишель (1998). История молекулярной биологии . Кембридж: Издательство Гарвардского университета. ISBN 978-0-674-00169-5.
- Лерер, Стивен (2006). Исследователи тела: драматические открытия в медицине от древних времен до современной науки . США: iUniverse. ISBN 978-0-595-40731-6.
- Фрай, Майкл (2016) Знаковые эксперименты в молекулярной биологии; Эльзевьер-Академик Пресс, США, ISBN 9780128020746
дальнейшее чтение
- Ледерберг Дж (февраль 1994 г.). «Трансформация генетики с помощью ДНК: празднование годовщины Эйвери, Маклауда и Маккарти (1944)» . Генетика . 136 (2): 423–6. PMC 1205797 . PMID 8150273 .
- Маккарти, Маклин (1986). Принцип трансформации: открытие того, что гены состоят из ДНК . Нью-Йорк: Нортон. ISBN 978-0-393-30450-3.
- Стегенга, Джейкоб (2011). «Химическая характеристика гена: превратности доказательной оценки» . История и философия наук о жизни . 33 (1): 105–127. PMID 21789957 .
Внешние ссылки
- Профили в науке: Коллекция Освальда Т. Эйвери