Молекулярная биология

Молекулярная биология / м ə л ɛ к J ʊ л ər / является отраслью биологии , что касается молекулярной основы биологической активности внутри и между клетками , в том числе молекулярно - синтезе, модификации, механизмов и взаимодействий. [1] [2] центральная догма молекулярной биологии описывает способ , в котором ДНК транскрибируется в РНК, а затем транслируется в белок. [2] [3]

Уильям Эстбери описал молекулярную биологию в 1961 году в журнале Nature следующим образом:

... не столько техника, сколько подход, подход с точки зрения так называемых фундаментальных наук с ведущей идеей поиска под крупномасштабными проявлениями классической биологии соответствующего молекулярного плана. Это особенно касается форм биологических молекул и [...] преимущественно трехмерно и структурно, что, однако, не означает, что это просто уточнение морфологии. Он должен одновременно исследовать происхождение и функцию. [4]

Некоторые клинические исследования и медицинские методы лечения, основанные на молекулярной биологии, охватываются генной терапией, тогда как использование молекулярной биологии или молекулярной клеточной биологии в медицине теперь называется молекулярной медициной . Молекулярная биология также играет важную роль в понимании образований, действий и регуляций различных частей клеток, которые можно использовать для эффективного нацеливания новых лекарств , диагностики заболеваний и понимания физиологии клетки. [5]

Хотя молекулярная биология стала официальной отраслью науки в 1930-х годах, этот термин был введен только в 1938 году Уорреном Уивером . В то время Уивер был директором отдела естественных наук в Фонде Рокфеллера и считал, что биология скоро претерпит значительные изменения из-за недавних достижений в таких технологиях, как рентгеновская кристаллография . [6] [7]

Молекулярная биология возникла как попытка ответить на вопросы о механизмах генетической наследственности и структуре гена . В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали двойную спиральную структуру ДНК благодаря работе по рентгеновской кристаллографии, выполненной Розалиндой Франклин и Морисом Уилкинсом . Уотсон и Крик описали структуру ДНК и взаимодействия внутри молекулы. Эта публикация дала толчок исследованиям в области молекулярной биологии и повысила интерес к этой теме. [8]

Схематическая взаимосвязь между биохимией , генетикой и молекулярной биологией

В следующем списке описывается точка зрения на междисциплинарные отношения между молекулярной биологией и другими смежными областями. [9]

Хотя исследователи практикуют методы, характерные для молекулярной биологии, их обычно комбинируют с методами генетики и биохимии . Большая часть молекулярной биологии носит количественный характер, и в последнее время значительный объем работы был проделан с использованием таких методов информатики, как биоинформатика и вычислительная биология . Молекулярная генетика , изучение структуры и функции генов, была одной из самых важных областей молекулярной биологии с начала 2000-х годов. Другие отрасли биологии опираются на молекулярную биологию, либо непосредственно изучая взаимодействия молекул сами по себе, например, в клеточной биологии и биологии развития , либо косвенно, когда молекулярные методы используются для вывода исторических атрибутов популяций или видов , как в области эволюционной биологии, такие как популяционная генетика и филогенетика . Также существует давняя традиция изучения биомолекул «с нуля» или на молекулярном уровне в биофизике . [12]

ДНК анимация

Молекулярное клонирование

Изображение трансдукции

Одним из основных методов молекулярной биологии для изучения функции белков является молекулярное клонирование . В этом методе ДНК, кодирующая интересующий белок, клонируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и / или рестрикционных ферментов в плазмиду ( вектор экспрессии ). Вектор имеет 3 отличительных признака: источник репликации, сайт множественного клонирования (MCS) и селективный маркер, обычно резистентный к антибиотикам . Перед сайтом множественного клонирования расположены промоторные области и сайт начала транскрипции, которые регулируют экспрессию клонированного гена. Эта плазмида может быть вставлена ​​как в бактериальные, так и в животные клетки. Введение ДНК в бактериальные клетки можно осуществить путем трансформации путем поглощения «голой» ДНК, конъюгации через межклеточный контакт или путем трансдукции через вирусный вектор. Введение ДНК в эукариотические клетки, такие как клетки животных, физическими или химическими средствами называется трансфекцией . Доступно несколько различных методов трансфекции, таких как трансфекция фосфатом кальция, электропорация , микроинъекция и трансфекция липосом . Плазмида может быть интегрирована в геном , что приводит к стабильной трансфекции, или может оставаться независимой от генома, что называется временной трансфекцией. [13] [14]

ДНК, кодирующая интересующий белок, теперь находится внутри клетки, и теперь белок может быть экспрессирован. Доступны различные системы, такие как индуцибельные промоторы и специфические клеточные сигнальные факторы, которые помогают экспрессировать представляющий интерес белок на высоких уровнях. Затем из бактериальной или эукариотической клетки можно экстрагировать большие количества белка. Белок можно тестировать на ферментативную активность в различных ситуациях, белок можно кристаллизовать, чтобы можно было изучить его третичную структуру , или, в фармацевтической промышленности, можно изучить активность новых лекарств против белка. [15]

Полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - чрезвычайно универсальный метод копирования ДНК. Вкратце, ПЦР позволяет копировать или модифицировать конкретную последовательность ДНК заданными способами. Реакция чрезвычайно мощная и в идеальных условиях может усилить одну молекулу ДНК до 1,07 миллиарда молекул менее чем за два часа. Метод ПЦР может использоваться для введения сайтов рестрикционных ферментов в концы молекул ДНК или для мутации определенных оснований ДНК, последний метод называется сайт-направленным мутагенезом . ПЦР также можно использовать для определения того, обнаружен ли конкретный фрагмент ДНК в библиотеке кДНК . ПЦР имеет множество разновидностей, таких как ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР ) для амплификации РНК и, в последнее время, количественная ПЦР, которая позволяет количественно измерять молекулы ДНК или РНК. [16] [17]

Гель-электрофорез

Два процента агарозного геля в боратном буфере броском в лотке геля.

Гель-электрофорез - один из основных инструментов молекулярной биологии. Основной принцип заключается в том, что ДНК, РНК и белки можно разделить с помощью электрического поля и размера. При электрофорезе в агарозном геле ДНК и РНК можно разделить по размеру, пропустив ДНК через электрически заряженный агарозный гель. Белки можно разделить по размеру с помощью геля SDS-PAGE или по размеру и их электрическому заряду с помощью так называемого 2D-гель-электрофореза . [18]

Блоттинг и зондирование макромолекул

Термины северный , вестерн и восточный блоттинг произошли от того, что изначально было шуткой молекулярной биологии, которая сыграла на термине Саузерн-блоттинг после метода, описанного Эдвином Саузерном для гибридизации блоттинга ДНК. Патрисия Томас, разработчик РНК-блота, который затем стал известен как нозерн-блот , на самом деле не использовала этот термин. [19]

Саузерн-блоттинг

Названный в честь своего изобретателя, биолога Эдвина Саузерна , Саузерн-блот представляет собой метод определения наличия определенной последовательности ДНК в образце ДНК. Образцы ДНК до или после расщепления рестриктазой (эндонуклеазой рестрикции) разделяют с помощью гель-электрофореза и затем переносят на мембрану путем блоттинга за счет капиллярного действия . Затем на мембрану воздействуют меченым ДНК-зондом, который имеет последовательность оснований комплемента к последовательности на интересующей ДНК. [20] Саузерн-блоттинг менее широко используется в лабораторных исследованиях из-за способности других методов, таких как ПЦР , обнаруживать определенные последовательности ДНК в образцах ДНК. Эти блоты все еще используются для некоторых применений, однако, таких как измерение трансгена числа копий в трансгенных мышей или в инженерии нокаут гена эмбриональные линии стволовых клеток . [12]

Нозерн-блоттинг

Схема Нозерн-блоттинга

Нозерн - блот используется для изучения присутствие специфических молекул РНК в качестве относительного сравнения между набором различных образцов РНК. По сути, это комбинация денатурирующего гель-электрофореза РНК и блоттинга . В этом процессе РНК разделяется по размеру и затем переносится на мембрану, которую затем исследуют меченым комплементом интересующей последовательности. Результаты могут быть визуализированы различными способами в зависимости от используемой метки; однако в большинстве случаев обнаруживаются полосы, представляющие размеры РНК, обнаруженной в образце. Интенсивность этих полос зависит от количества целевой РНК в анализируемых образцах. Эта процедура обычно используется для изучения того, когда и в какой степени происходит экспрессия гена, путем измерения того, сколько этой РНК присутствует в разных образцах, предполагая, что посттранскрипционная регуляция не происходит и что уровни мРНК отражают пропорциональные уровни соответствующего белка произведено. Это один из основных инструментов для определения того, в какое время и при каких условиях определенные гены экспрессируются в живых тканях. [21] [22]

Вестерн-блоттинг

При вестерн-блоттинге белки сначала разделяются по размеру в тонком геле, зажатом между двумя стеклянными пластинами, с помощью метода, известного как SDS-PAGE . Затем белки в геле переносятся на поливинилиденфторид (ПВДФ), нитроцеллюлозу, нейлон или другую поддерживающую мембрану. Затем эту мембрану можно исследовать с помощью растворов антител . Антитела, которые специфически связываются с интересующим белком, затем можно визуализировать с помощью различных методов, включая окрашенные продукты, хемилюминесценцию или авторадиографию . Часто антитела метят ферментами. Когда хемилюминесцентный субстрат подвергается воздействию фермента, он позволяет обнаруживать. Использование методов вестерн-блоттинга позволяет не только обнаруживать, но и проводить количественный анализ. Методы, аналогичные вестерн-блоттингу, можно использовать для прямого окрашивания определенных белков в живых клетках или срезах тканей . [23] [24]

Восточный блоттинг

Восточный блоттинг метод используются для выявления посттрансляционной модификации белков. Белки, нанесенные на PVDF или нитроцеллюлозную мембрану, исследуются на предмет модификаций с использованием определенных субстратов. [25]

Микрочипы

"> Воспроизвести медиа
Печатается микроматрица ДНК
Гибридизация мишени с зондом

Микрочипов ДНК представляет собой совокупность точек , прикрепленных к твердой подложке , таким как стекло микроскопа , где каждое пятно содержит один или более одноцепочечной ДНК олигонуклеотидных фрагментов. Матрицы позволяют наносить большое количество очень маленьких (диаметром 100 микрометров) пятен на одном предметном стекле. Каждое пятно имеет молекулу фрагмента ДНК, которая комплементарна одной последовательности ДНК . Разновидность этого метода позволяет экспрессии генов организма на определенной стадии развития , чтобы быть квалифицированы ( выражение профилирование ). В этом методе РНК в ткани выделяется и превращается в меченую комплементарную ДНК (кДНК). Эта кДНК затем гибридизируется с фрагментами в массиве, и может быть выполнена визуализация гибридизации. Поскольку можно создать несколько массивов с точно таким же расположением фрагментов, они особенно полезны для сравнения экспрессии генов двух разных тканей, таких как здоровая и раковая ткань. Кроме того, можно измерить, какие гены экспрессируются и как это выражение меняется со временем или с другими факторами. Есть много разных способов изготовления микроматриц; наиболее распространены кремниевые чипы, предметные стекла микроскопа с пятнами диаметром ~ 100 микрометров, нестандартные матрицы и матрицы с более крупными пятнами на пористых мембранах (макроматрицы). В одном массиве может быть от 100 до более 10 000 точек. Массивы также могут быть сделаны с молекулами, отличными от ДНК. [26] [27] [28] [29]

Аллель-специфический олигонуклеотид

Аллель-специфический олигонуклеотид (ASO) - это метод, который позволяет обнаруживать мутации единичных оснований без необходимости ПЦР или гель-электрофореза. Короткие (длиной 20-25 нуклеотидов) меченые зонды подвергаются воздействию нефрагментированной целевой ДНК, гибридизация происходит с высокой специфичностью из-за малой длины зондов, и даже одно изменение основания будет препятствовать гибридизации. Затем целевая ДНК промывается, и меченые зонды, которые не гибридизуются, удаляются. Затем ДНК-мишень анализируется на наличие зонда по радиоактивности или флуоресценции. В этом эксперименте, как и в большинстве методов молекулярной биологии, необходимо использовать контроль для обеспечения успешного эксперимента. [30] [31]

SDS-СТРАНИЦА

В молекулярной биологии постоянно развиваются процедуры и технологии, а от старых технологий отказываются. Например, до появления гель-электрофореза ДНК ( агароза или полиакриламид ) размер молекул ДНК обычно определялся скоростью осаждения в градиентах сахарозы , медленный и трудоемкий метод, требующий дорогостоящего оборудования; до градиентов сахарозы использовали вискозиметрию . Помимо их исторического интереса, часто стоит знать о более старых технологиях, поскольку иногда бывает полезно решить другую новую проблему, для которой новая техника не подходит. [32]

  • Астробиология
  • Центральная догма молекулярной биологии
  • Генетический код
  • Геном
  • Институты молекулярной биологии
  • Молекулярная инженерия
  • Молекулярная микробиология
  • Молекулярное моделирование
  • Прогнозирование белкового взаимодействия
  • Прогноз структуры белка
  • Протеом
  • Клеточная биология

  1. Перейти ↑ Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, Walter P (2014). Молекулярная биология клетки, шестое издание . Наука о гирляндах. С. 1–10. ISBN 978-1-317-56375-4.
  2. ^ а б Гэннон Ф (февраль 2002 г.). "Молекулярная биология - что в названии?" . EMBO Reports . 3 (2): 101. DOI : 10.1093 / embo-reports / kvf039 . PMC  1083977 . PMID  11839687 .
  3. ^ Кокс, Майкл М. (2015-03-16). Молекулярная биология: принципы и практика . Дудна, Дженнифер А. ,, О'Доннелл, Майкл (биохимик) (второе изд.). Нью-Йорк. ISBN 978-1-4641-2614-7. OCLC  905380069 .
  4. ^ Astbury WT (июнь 1961 г.). "Молекулярная биология или ультраструктурная биология?" . Природа . 190 (4781): 1124. Bibcode : 1961Natur.190.1124A . DOI : 10.1038 / 1901124a0 . PMID  13684868 . S2CID  4172248 .
  5. ^ Белло Э.А., Швинн Д.А. (декабрь 1996 г.). «Молекулярная биология и медицина. Учебник для клинициста». Анестезиология . 85 (6): 1462–78. DOI : 10.1097 / 00000542-199612000-00029 . PMID  8968195 . S2CID  29581630 .
  6. ^ Уивер W (ноябрь 1970 г.). «Молекулярная биология: происхождение термина». Наука . 170 (3958): 581–2. Bibcode : 1970Sci ... 170R.581W . DOI : 10.1126 / science.170.3958.581-а . PMID  4919180 .
  7. ^ Байнум В. (1 февраля 1999 г.). «История молекулярной биологии». Природная медицина . 5 (2): 140. DOI : 10.1038 / 5498 . ISSN  1078-8956 . S2CID  1497333 .
  8. ^ Табери, Моника, Джеймс, Пиотровска; Дарден, Линдли (2019), «Молекулярная биология» , в Залте, Эдвард Н. (редактор), Стэнфордская энциклопедия философии (издание осень 2019 г.), Исследовательская лаборатория метафизики, Стэнфордский университет , получено 19 апреля 2020 г.
  9. ^ Лодиш Х, Берк А, Зипурски С.Л., Мацудаира П., Балтимор Д., Дарнелл Дж. (2000). Молекулярная клеточная биология (4-е изд.). Нью-Йорк: Книги Scientific American. ISBN 978-0-7167-3136-8.
  10. ^ Берг, Джереми (2002). Биохимия . Тимочко, Джон Л .; Страйер, Люберт (5-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 0-7167-3051-0. OCLC  48055706 .
  11. ^ Справка, Genetics Home. «Помогите мне понять генетику» . Домашний справочник по генетике . Проверено 31 декабря 2016 года .
  12. ^ а б Тиан Дж., Изд. (2013). Молекулярная визуализация: основы и приложения . Springer-Verlag Berlin & Heidelberg GmbH & Co. K. p. 542. ASIN  B010BENEB6 . ISBN 9783642343032. Проверено 8 июля 2019 .
  13. ^ Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. Выделение, клонирование и секвенирование ДНК . Проверено 31 декабря 2016 года .
  14. ^ Лессард, Джулиана К. (1 января 2013 г.). «Молекулярное клонирование». Лабораторные методы в энзимологии: ДНК . Методы в энзимологии . 529 . С. 85–98. DOI : 10.1016 / B978-0-12-418687-3.00007-0 . ISBN 978-0-12-418687-3. ISSN  1557-7988 . PMID  24011038 .
  15. ^ Кокате К., Jalalpure SS, Hurakadle PJ (2016). Учебник фармацевтической биотехнологии . Клонирование экспрессии. Эльзевир. п. 125. ASIN  B0198ZLOKM . ISBN 9788131239872. Проверено 8 июля 2019 .
  16. ^ «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)» . Национальный центр биотехнологической информации . Национальная медицинская библиотека США . Проверено 31 декабря 2016 года .
  17. ^ «Информационный бюллетень по полимеразной цепной реакции (ПЦР)» . Национальный институт исследования генома человека (NHGRI) . Проверено 31 декабря 2016 года .
  18. ^ Ли PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH (апрель 2012 г.). «Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК» . Журнал визуализированных экспериментов (62). DOI : 10.3791 / 3923 . PMC  4846332 . PMID  22546956 .
  19. ^ Томас PS (сентябрь 1980 г.). «Гибридизация денатурированной РНК и малых фрагментов ДНК, перенесенных на нитроцеллюлозу» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 77 (9): 5201–5. Bibcode : 1980PNAS ... 77.5201T . DOI : 10.1073 / pnas.77.9.5201 . PMC  350025 . PMID  6159641 .
  20. ^ Браун Т (май 2001 г.). «Саузерн-блоттинг». Текущие протоколы в иммунологии . Глава 10: Блок 10.6A. DOI : 10.1002 / 0471142735.im1006as06 . ISBN 978-0-471-14273-7. PMID  18432697 . S2CID  20686993 .
  21. ^ Йозефсен К., Нильсен Х (2011). Нильсен Х (ред.). Методы и протоколы РНК . Методы молекулярной биологии. 703 . Нью-Йорк: Humana Press. С. 87–105. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-248-9_7 . ISBN 978-1-59745-248-9. PMID  21125485 .
  22. ^ He SL, Green R (1 января 2013 г.). «Нозерн-блоттинг» . Методы в энзимологии . 530 : 75–87. DOI : 10.1016 / B978-0-12-420037-1.00003-8 . ISBN 978-0-12-420037-1. PMC  4287216 . PMID  24034315 .
  23. ^ Махмуд Т., Ян П.К. (сентябрь 2012 г.). «Вестерн-блоттинг: техника, теория и устранение неполадок» . Североамериканский журнал медицинских наук . 4 (9): 429–34. DOI : 10.4103 / 1947-2714.100998 . PMC  3456489 . PMID  23050259 .
  24. ^ Куриен Б.Т., Скофилд Р.Х. (апрель 2006 г.). «Вестерн-блоттинг». Методы . 38 (4): 283–93. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2005.11.007 . PMID  16483794 . - через ScienceDirect (может потребоваться подписка или контент может быть доступен в библиотеках.) 
  25. ^ Томас С., Тирумалапура Н., Кроссли Е.К., Исмаил Н., Уокер Д.Х. (июнь 2009 г.). «Модификации антигенных белков у Эрлихии» . Иммунология паразитов . 31 (6): 296–303. DOI : 10.1111 / j.1365-3024.2009.01099.x . PMC  2731653 . PMID  19493209 .
  26. ^ «Микроматрицы» . Национальный центр биотехнологической информации . Национальная медицинская библиотека США . Проверено 31 декабря 2016 года .
  27. ^ Бумгарнер Р. (январь 2013 г.). Фредерик М. Осубель и др. (ред.). «Обзор ДНК-микрочипов: типы, приложения и их будущее» . Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 22: Раздел 22.1. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb2201s101 . ISBN 978-0-471-14272-0. PMC  4011503 . PMID  23288464 .
  28. ^ Говиндараджан Р., Дурайян Дж., Калиаппан К., Паланисами М. (август 2012 г.). «Микромассив и его приложения» . Журнал фармации и биологических наук . 4 (Приложение 2): S310-2. DOI : 10.4103 / 0975-7406.100283 . PMC  3467903 . PMID  23066278 .
  29. ^ Tarca AL, Romero R, Draghici S (август 2006 г.). «Анализ микроматричных экспериментов по профилированию экспрессии генов» . Американский журнал акушерства и гинекологии . 195 (2): 373–88. DOI : 10.1016 / j.ajog.2006.07.001 . PMC  2435252 . PMID  16890548 .
  30. ^ Cheng L, Zhang DY, ред. (2008). Молекулярно-генетическая патология . Тотова, Нью-Джерси: Humana. п. 96. ISBN 978-1-59745-405-6. Проверено 31 декабря 2016 года .
  31. ^ Леонард Д.Г. (2016). Молекулярная патология в клинической практике . Springer. п. 31. ISBN 978-3-319-19674-9. Проверено 31 декабря 2016 года .
  32. ^ Тиан Дж., Изд. (2013). Молекулярная визуализация: основы и приложения . Springer-Verlag Berlin & Heidelberg GmbH & Co.K. С. 550, 552. ISBN 9783642343032. Проверено 8 июля 2019 .

  • Коэн С.Н., Чанг А.С., Бойер Х.В., Хеллинг, РБ (ноябрь 1973 г.). «Конструирование биологически функциональных бактериальных плазмид in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 70 (11): 3240–4. Bibcode : 1973PNAS ... 70.3240C . DOI : 10.1073 / pnas.70.11.3240 . PMC  427208 . PMID  4594039 .
  • Роджерс М (июнь 1975 г.). "Ящик Пандоры съезд". Rolling Stone . 189 : 37–77.
  • Робертс К., Рафф М., Альбертс Б., Уолтер П., Льюис Дж, Джонсон А. (2002). Молекулярная биология клетки . Наука о гирляндах. ISBN 978-0-8153-3218-3.

  • СМИ, связанные с молекулярной биологией, на Викискладе?
  • Биохимия и молекулярная биология в Curlie