Карбоксипептидаза А

Кроме того, есть еще 4 фермента млекопитающих, названные от CPA-3 до CPA-6, и ни один из них не экспрессируется в поджелудочной железе. Вместо этого эти другие CPA-подобные ферменты выполняют разнообразные функции.

CPA3 (также известный как CPA тучных клеток) участвует в переваривании белков тучными клетками .
CPA4 (ранее известный как CPA-3, но перенумерованный, когда CPA тучных клеток был обозначен как CPA-3) может участвовать в прогрессировании опухоли , но этот фермент недостаточно изучен.
CPA5 изучен недостаточно.
CPA6 экспрессируется во многих тканях во время развития мышей, а у взрослых обнаруживает более ограниченное распределение в головном мозге и некоторых других тканях. CPA6 присутствует во внеклеточном матриксе, где он ферментативно активен. Человеческая мутация CPA-6 была связана с синдромом Дуэйна (аномальное движение глаз). Недавно было обнаружено, что мутации в CPA6 связаны с эпилепсией.

Функция [ править ]

CPA-1 и CPA-2 (и, как предполагается, все другие CPA) используют ион цинка в белке для гидролиза пептидной связи на С-конце аминокислотного остатка. Потеря цинка приводит к потере активности, которую можно легко заменить цинком, а также некоторыми другими двухвалентными металлами ( кобальтом , никелем ). Карбоксипептидаза А продуцируется в поджелудочной железе и имеет решающее значение для многих процессов в организме человека, включая пищеварение, посттрансляционную модификацию белков, свертывание крови и размножение.

Приложения [ править ]

Такой обширный набор функций для одного белка делает его идеальной моделью для исследований других протеаз цинка неизвестной структуры. Недавние биомедицинские исследования коллагеназы, энкефлиназы и ангиотензинпревращающего фермента использовали карбоксипептидазу А для синтеза ингибитора и кинетических испытаний. Например, препарат для лечения высокого кровяного давления Каптоприл был разработан на основе ингибитора карбоксипептидазы А. Карбоксипептидаза А и целевой фермент каптоприла, ангиотензинпревращающего фермента, имеют очень похожие структуры, поскольку оба они содержат ион цинка в активном центре. Это позволило использовать мощный ингибитор карбоксипептидазы А для ингибирования фермента и, таким образом, снижения артериального давления через систему ренин-ангиотензин-альдостерон. ^[1]

Структура [ править ]

Карбоксипептидаза A (CPA) содержит металлический центр цинка (Zn ²⁺ ) в тетраэдрической геометрии с аминокислотными остатками в непосредственной близости от цинка для облегчения катализа и связывания. Из 307 аминокислот, связанных в пептидной цепи, следующие аминокислотные остатки важны для катализа и связывания; Glu-270, Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145 и Tyr-248. Рисунок 1 иллюстрирует активный центр тетраэдрического цинкового комплекса с важными аминокислотными остатками, которые окружают комплекс. ^[2]

Металлический цинк представляет собой сильный электрофильный катализатор на основе кислоты Льюиса, который стабилизирует координированную молекулу воды, а также стабилизирует отрицательные промежуточные соединения, которые возникают на протяжении гидролитической реакции. Стабилизации как скоординированной молекулы воды, так и отрицательных промежуточных продуктов способствуют полярные остатки в активном центре, которые находятся в непосредственной близости для облегчения водородных связей. ^[2]

Рисунок 1. Активный сайт CPA

Активный сайт можно разделить на два подсайта, обозначенных как S ₁ 'и S ₁ . Субсайт S ₁ 'представляет собой гидрофобный карман фермента, а Tyr-248 действует, «закрывая» гидрофобный карман после связывания субстрата или ингибитора (SITE). ^[2] Водородная связь от гидроксильной группы в Tyr-248 облегчает эту конформацию из-за взаимодействия с концевыми карбоксилатами связывающихся субстратов. Для этого фермента требуется значительное движение, и модель индуцированной подгонки объясняет, как происходит это взаимодействие.

Триада остатков взаимодействуют с C-концевым карбоксилатом через водородную связь:

Солевое связывание с положительно заряженным Arg-145
Водородная связь из Tyr-248
Водородная связь из азота амида Asn-144

Механизм [ править ]

Карбоксипептидаза А, классифицируемая как металлоэкзопептидаза, состоит из одной полипептидной цепи, связанной с ионом цинка. Этот характерный ион металла расположен в активном центре фермента вместе с пятью аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании субстрата: Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145, Tyr-248 и Glu- 270. Рентгеноструктурные исследования выявили пять участков белка. Эти аллостерические сайты участвуют в создании специфичности лиганд-фермент, наблюдаемой у большинства биоактивных ферментов. Один из этих субсайтов вызывает конформационное изменение Tyr-248 при связывании молекулы субстрата в первичном активном сайте. Фенольный гидроксил тирозина образует водородную связь с концевым карбоксилатом лиганда. Кроме того,вторая водородная связь образуется между тирозином и пептидной связью более длинных пептидных субстратов. Эти изменения значительно усиливают связь между ферментом и лигандом, будь то субстрат или ингибитор. Это свойство карбоксипептидазы А привело к первому пунктуГипотеза Дэниела Э. Кошланда-младшего о «индуцированной пригодности».

Субсайт S ₁ - это место, где катализ происходит в CPA, а ион цинка координируется остатками ферментов Glu-72, His-69 и His-196. Существует плоскость, которая пересекает бороздку активного центра, где остатки Glu-270 и Arg-127 находятся на противоположных сторонах комплекса, связанного с цинком и водой. Цинк богат электронами из-за глутаминовых лигандов, координирующих цинк, потому что до связывания субстрата Glu-72 координирует бидентатно, но переходит в монодентатный после связывания субстрата. В результате металлический цинк не может депротонировать координированную молекулу воды с образованием гидроксильного нуклеофила. ^[2]

Рисунок 2. Протеолиз, катализируемый CPA, которому способствует координированная молекула воды.

Glu-270 и Arg-127 играют важную роль в катализе, показанном на рисунке 2. Arg-127 действует, стабилизируя карбонил субстрата, который связан с аминогруппой фенилаланина. Одновременно молекула воды, координированная с цинком, депротонируется Glu-270 и взаимодействует с карбонилом, стабилизированным Arg-127. Это создает промежуточное соединение, показанное на рисунке 2, где отрицательно заряженный кислород координируется с цинком, и благодаря неблагоприятным электростатическим взаимодействиям между Glu-270 и ионизированным продуктом облегчается высвобождение продукта в конце катализа. ^[2]

В недавних компьютерных исследованиях механизм катализа аналогичен, но разница в механизме состоит в том, что молекула депротонированной воды связывается с углеродом карбонила, тогда как на рисунке 2 показано, что гидроксильная группа остается скоординированной с цинком. Затем происходит протеолиз, и молекула воды снова вводится в активный центр для координации с цинком. ^[3]

Было проведено несколько исследований, изучающих детали связи между карбоксипептидазой А и субстратом и ее влияние на скорость гидролиза. В 1934 году в ходе кинетических экспериментов было впервые обнаружено, что для связывания субстрата гидролизуемый пептид должен находиться рядом с концевой свободной гидроксильной группой. Также скорость гидролиза может быть увеличена, если C-концевой остаток является разветвленным алифатическим или ароматическим. Однако, если субстрат представляет собой дипептид со свободной аминогруппой, он медленно подвергается гидролизу; этого, однако, можно избежать, если аминогруппа блокируется N-ацилированием ^[4]

Совершенно очевидно, что структура фермента, а точнее его активный центр, очень важна для понимания механизма реакции. По этой причине Рис и его коллеги изучили комплекс фермент-лиганд, чтобы получить четкий ответ о роли иона цинка. Эти исследования показали, что в свободном ферменте координационное число цинка равно пяти; металлический центр координирован с двумя атомами азота имидазола Nδ1, двумя карбоксилатными атомами кислорода глутамата-72 и молекулой воды с образованием искаженного тетраэдра. Однако, как только лиганд связывается в активном центре карбоксипептидазы A, это координационное число может варьироваться от пяти до шести. При связывании с дипептидом глицил-L-тирозином аминный азот дипептида и карбонильный кислород замещают водный лиганд.Это дало бы координационное число шесть для цинка в комплексе карбоксипептидаза А-дипептид-глицил-L-тирозин. Карты электронной плотности показали, что аминный азот занимает вторую позицию рядом с глутаматом-270. Близость этих двух остатков приведет к стерическому затруднению, препятствующему координации водного лиганда с цинком. Это приведет к координационному числу пять. Данные по обоим значительны, что указывает на то, что обе ситуации возникают естественным образом.указывает на то, что обе ситуации возникают естественным образомуказывает на то, что обе ситуации возникают естественным образом^[5]

Существует два предложенных механизма каталитической функции карбоксипептидазы А. Первый представляет собой нуклеофильный путь с участием ковалентного ацильного промежуточного фермента, содержащего основание активного центра Glu-270. Доказательства существования этого промежуточного ангидрида неоднозначны; Сух и его коллеги выделили то, что предполагается ацильным промежуточным соединением. Однако подтверждение наличия ацильного фермента было выполнено без экспериментов по улавливанию, что делает выводы слабыми. ^[1]

Второй предложенный механизм - это продвижение воды. Этот механизм включает атаку молекулы воды на ножничную пептидную связь субстрата. Этому процессу способствует ион цинка и остаток Glu-270. ^[1]

См. Также [ править ]

Ингибитор карбоксипептидазы А
Карбоксипептидаза B
Карбоксипептидаза
Карбоксипептидаза E

Ссылки [ править ]

^ a b c Кристиансон Д. В., Липскомб В. Н. (февраль 1989 г.). «Карбоксипептидаза А». Счета химических исследований . 22 (2): 62–9. DOI : 10.1021 / ar00158a003 .
^ a b c d e Кристиансон, Д., В., и Липскомб, В., Н. (1989) Карбоксипептидаза А. Американское химическое общество , Том (22): 62-69.
Перейти ↑ Valdez CE, Morgenstern A, Eberhart ME, Alexandrova AN (ноябрь 2016 г.). «Прогностические методы для вычислительной редизайна металлоферментов - тестовый пример с карбоксипептидазой А» . Физическая химия Химическая физика . 18 (46): 31744–31756. Bibcode : 2016PCCP ... 1831744V . DOI : 10.1039 / c6cp02247b . PMID 27841396 .
^ Lipscomb WN (март 1970). «Структура и механизм ферментативной активности карбоксипептидазы А и отношения к химической последовательности». Счета химических исследований . 3 (3): 81–9. DOI : 10.1021 / ar50027a001 .
^ Rees DC, Льюис М, Honzatko RB, Lipscomb WN, Хардмэн KD (июнь 1981). «Цинковая среда и цис-пептидные связи в карбоксипептидазе А с разрешением 1,75-А» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (6): 3408–12. Полномочный код : 1981PNAS ... 78.3408R . DOI : 10.1073 / pnas.78.6.3408 . PMC 319577 . PMID 6943549 .

Внешние ссылки [ править ]

Merops онлайновой базы данных для пептидазы и их ингибиторов: M14.001
Карбоксипептидазы + A в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)

[Christianson_1989-1] Кристиансон Д. В., Липскомб В. Н. (февраль 1989 г.). «Карбоксипептидаза А». Счета химических исследований . 22 (2): 62–9. DOI : 10.1021 / ar00158a003 .

[:02-2] Кристиансон, Д., В., и Липскомб, В., Н. (1989) Карбоксипептидаза А. Американское химическое общество , Том (22): 62-69.

[3] Перейти ↑ Valdez CE, Morgenstern A, Eberhart ME, Alexandrova AN (ноябрь 2016 г.). «Прогностические методы для вычислительной редизайна металлоферментов - тестовый пример с карбоксипептидазой А» . Физическая химия Химическая физика . 18 (46): 31744–31756. Bibcode : 2016PCCP ... 1831744V . DOI : 10.1039 / c6cp02247b . PMID 27841396 .

[4] Lipscomb WN (март 1970). «Структура и механизм ферментативной активности карбоксипептидазы А и отношения к химической последовательности». Счета химических исследований . 3 (3): 81–9. DOI : 10.1021 / ar50027a001 .

[pmid6943549-5] Rees DC, Льюис М, Honzatko RB, Lipscomb WN, Хардмэн KD (июнь 1981). «Цинковая среда и цис-пептидные связи в карбоксипептидазе А с разрешением 1,75-А» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (6): 3408–12. Полномочный код : 1981PNAS ... 78.3408R . DOI : 10.1073 / pnas.78.6.3408 . PMC 319577 . PMID 6943549 .

vтеФерменты
Активность	Активный сайт Связывающий сайт Каталитическая триада Оксианионная дыра Ферментная неразборчивость Каталитически совершенный фермент Коэнзим Кофактор Ферментный катализ
Регулирование	Аллостерическая регуляция Сотрудничество Ингибитор ферментов Активатор ферментов
Классификация	Номер ЕС Ферментное суперсемейство Семейство ферментов Список ферментов
Кинетика	Кинетика ферментов Диаграмма Иди – Хофсти Заговор Ханеса – Вульфа Заговор Лайнуивера – Берка Кинетика Михаэлиса – Ментен
Типы	EC1 Оксидоредуктазы ( список ) EC2 Трансферазы ( список ) EC3 Гидролазы ( список ) EC4 Lyases ( список ) EC5 Изомеразы ( список ) Лигазы EC6 ( список ) EC7 Translocases ( список )