ChiRP-Seq (выделение хроматина путем очистки РНК ) - это высокопроизводительный метод секвенирования для обнаружения участков генома, которые связаны определенной РНК (или рибонуклеопротеином, содержащим интересующую РНК). Недавние исследования показали, что значительная часть некоторых геномов (включая геномы мыши и человека) синтезирует РНК, которая, по-видимому, не кодирует белки. Функция большинства из этих некодирующих РНКеще предстоит выяснить. Разрабатываются различные геномные методы для картирования функциональной ассоциации этих новых РНК с отдельными участками генома, чтобы лучше понять их функцию. ChiRP-Seq - один из этих новых методов, который использует возможность массового параллельного секвенирования секвенаторов 2-го поколения для каталогизации сайтов связывания этих новых молекул РНК в геноме.
Обзор метода
Десятки олигонуклеотидных зондов созданы так, чтобы быть комплементарными интересующей РНК. Эти олигонуклеотиды помечены биотином . Клетки сшивают УФ-излучением или формалином, и из этих обработанных клеток выделяют ядра. Выделенные ядра лизировали, а высвободившийся хроматин фрагментировали обработкой ультразвуком с получением фрагментов размером примерно 100-500 п.н. Эти фрагменты хроматина гибридизовали с набором биотинилированных зондов. Комплексы, содержащие биотин-зонд + интересующая РНК + фрагмент ДНК, захватываются магнитными шариками, меченными стрептавидином .
ДНК выделяют из аликвоты связанного комплекса обработкой РНКазой (или протеиназой с последующей РНКазой) для переваривания связанного белка и РНК. РНК также может быть выделена из дополнительной аликвоты связанного комплекса для обнаружения других молекул РНК, связанных с интересующей РНК. Затем очищенная ДНК используется для подготовки библиотеки секвенирования, и эта библиотека секвенируется в системе секвенирования ДНК следующего поколения. Затем считывания секвенирования сопоставляются с геномом. Накопление считываний в определенных местах генома указывает на то, что интересующая РНК связана с этой областью генома. Это помогает очертить определенные области генома, которые взаимодействуют с РНК. Например, геномные мишени энхансерной РНК, которые действуют на расстоянии от места их синтеза, можно легко оценить с помощью ChiRP-Seq. [1] [2]
Рекомендации
- ^ Чу, Ки; Цюй, Кун; Чжун, Франклин Л .; Artandi, Steven E .; Чанг, Ховард Ю. (31 августа 2011 г.). «Геномные карты длинного некодирующего присутствия РНК раскрывают принципы взаимодействия РНК-хроматин» . Молекулярная клетка . 44 : 667–678. DOI : 10.1016 / j.molcel.2011.08.027 . PMC 3249421 . PMID 21963238 .
- ^ Li, W .; Notani, D .; Ma, Q .; Tanasa, B .; Nunez, E .; и другие. (2013). «Функциональные роли энхансерных РНК для эстроген-зависимой транскрипционной активации» . Природа . 498 : 516–520. DOI : 10,1038 / природа12210 . PMC 3718886 . PMID 23728302 .