Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Для гемопоэтических клеток человека см. Гематопоэтические стволовые клетки .

Колониеобразующих единицы ( КОЕ, КОЕ, КОЕ ) является единицей , используемой в микробиологии , чтобы оценить количество жизнеспособных бактерий или грибковых клеток в образце. Жизнеспособность определяется как способность к размножению посредством двойного деления в контролируемых условиях. Подсчет с помощью колониеобразующих единиц требует культивирования микробов и подсчета только жизнеспособных клеток, в отличие от микроскопического исследования, при котором подсчитываются все клетки, живые или мертвые. Внешний вид колонии в культуре клеток требует значительного роста, и при подсчете колоний неясно, возникла ли колония из одной клетки или группы клеток. Выражение результатов в виде колониеобразующих единиц отражает эту неопределенность.

Теория [ править ]

Разбавление, сделанное с помощью бактерий и пептонной воды, помещают в чашку с агаром ( подсчет в чашках с агаром для образцов пищевых продуктов или соевый агар с триптиказой для клинических образцов) и распределяют по чашке, наклоняя ее в соответствии с показанной схемой.

Целью подсчета на чашке является оценка количества присутствующих клеток на основе их способности давать рост колонии в определенных условиях питательной среды, температуры и времени. Теоретически одна жизнеспособная клетка может дать начало колонии путем репликации. Однако одиночные клетки являются исключением в природе, и, скорее всего, прародителем колонии была масса клеток, депонированных вместе. [ необходима цитата ] Кроме того, многие бактерии растут цепочками (например, Streptococcus ) или группами (например, Staphylococcus). Оценка микробного числа по КОЕ в большинстве случаев занижает количество живых клеток, присутствующих в образце по этим причинам. Это связано с тем, что подсчет КОЕ предполагает, что каждая колония является отдельной и основана на одной жизнеспособной микробной клетке. [1]

Подсчет на чашке является линейным для E. coli в диапазоне от 30 до 300 КОЕ на чашке Петри стандартного размера . [2] Следовательно, чтобы гарантировать, что образец будет давать КОЕ в этом диапазоне, необходимо разбавить образец и посеять несколько разведений. Обычно используются десятикратные разведения, и серии разведений наносят на чашки в двух или трех экземплярах в выбранном диапазоне разведений. Часто на чашки высевают 100 мкл, но также используются большие количества - до 1 мл. Более высокие объемы покрытия увеличивают время сушки, но часто не приводят к более высокой точности, поскольку могут потребоваться дополнительные этапы разбавления. [3]КОЕ / планшет считывают с планшета в линейном диапазоне, а затем рассчитывают КОЕ / г (или КОЕ / мл) оригинала математически с учетом нанесенного количества и его коэффициента разбавления (например, CLSI VET01S ).

Раствор бактерий с неизвестной концентрацией часто серийно разбавляют , чтобы получить хотя бы одну чашку со счетным числом бактерий. На этом рисунке для счета подходит пластина «x10».

Преимущество этого метода заключается в том, что разные виды микробов могут давать рост колоний, которые явно отличаются друг от друга как микроскопически, так и макроскопически . Морфологии колонии может быть весьма полезным в идентификации микроорганизма , присутствующего. [ необходима цитата ]

Предварительное понимание микроскопической анатомии организма может дать лучшее понимание того, как наблюдаемые КОЕ / мл соотносятся с количеством жизнеспособных клеток на миллилитр. В качестве альтернативы в некоторых случаях можно уменьшить среднее количество клеток на КОЕ, взбалтывая образец перед проведением разведения. Однако многие микроорганизмы являются хрупкими, и их доля жизнеспособных клеток уменьшается при помещении их в вихрь. [ необходима цитата ]

Обозначение журнала [ править ]

Концентрации колониеобразующих единиц могут быть выражены с использованием логарифмической записи, где указанное значение представляет собой десятичный логарифм концентрации. [4] [5] [6] Это позволяет вычислить логарифмическое сокращение процесса дезактивации как простое вычитание.

Использует [ редактировать ]

Колониеобразующие единицы используются для количественной оценки результатов во многих микробиологических методах посева и подсчета, включая:

  • Метод Pour Plate, при котором образец суспендируют в чашке Петри с использованием расплавленного агара, охлажденного примерно до 40-45 ° C (чуть выше точки затвердевания, чтобы минимизировать гибель клеток, вызванную нагревом). После застывания питательного агара планшет инкубируют. [7]
  • Метод Spread Plate, при котором образец (в небольшом объеме) распределяют по поверхности чашки с питательным агаром и дают ему высохнуть перед инкубацией для подсчета. [7]
  • Метод мембранного фильтра, при котором образец фильтруется через мембранный фильтр, затем фильтр помещается на поверхность чашки с питательным агаром (бактериями вверх). Во время инкубации питательные вещества просачиваются через фильтр, поддерживая рост клеток. Поскольку площадь поверхности большинства фильтров меньше, чем у стандартной чашки Петри, линейный диапазон подсчета на чашке будет меньше. [7]
  • Метод Майлза и Мисры или метод капельной чашки, при котором очень небольшая аликвота (обычно около 10 микролитров) образца из каждого разведения в серии капают в чашку Петри. Чашку-каплю необходимо считывать, пока колонии очень малы, чтобы предотвратить потерю КОЕ при их совместном срастании. [ необходима цитата ]

Однако с помощью методов, требующих использования чашки с агаром, нельзя использовать жидкий раствор, потому что чистота образца не может быть неидентифицирована, и невозможно подсчитать клетки в жидкости по одной. [8]

Инструменты для подсчета колоний [ править ]

Традиционный способ подсчета КОЕ с помощью «счетчика щелчков» и ручки. Когда колоний слишком много, обычно считают КОЕ только на части чашки.

Подсчет колоний традиционно выполняется вручную с помощью ручки и счетчика щелчков. Как правило, это простая задача, но она может стать очень трудоемкой и отнимать много времени, когда необходимо перечислить много пластин. В качестве альтернативы можно использовать полуавтоматические (программные) и автоматические (аппаратные + программные) решения. [ необходима цитата ]

Программное обеспечение для подсчета КОЕ [ править ]

Колонии можно подсчитать по фотографиям тарелок с помощью программных средств. Экспериментаторы обычно фотографируют каждую тарелку, которую им нужно посчитать, а затем анализируют все изображения (это можно сделать с помощью простой цифровой камеры или даже веб-камеры). Поскольку для получения одного снимка требуется менее 10 секунд, в отличие от нескольких минут для подсчета КОЕ вручную, такой подход обычно экономит много времени. Кроме того, он более объективен и позволяет извлекать другие переменные, такие как размер и цвет колоний.

  • OpenCFU [1] - это бесплатная программа с открытым исходным кодом, разработанная для повышения удобства использования, скорости и надежности. Он предлагает широкий спектр фильтров и элементов управления, а также современный пользовательский интерфейс. OpenCFU написан на C ++ и использует OpenCV для анализа изображений. [9]
  • NICE - это программа, написанная на MATLAB, которая обеспечивает простой способ подсчета колоний по изображениям. [10] [11]
  • ImageJ и CellProfiler : Некоторые макросы ImageJ [12] и плагины, а также некоторые конвейеры CellProfiler [13] могут использоваться для подсчета колоний. Это часто требует от пользователя изменения кода для достижения эффективного рабочего процесса, но может оказаться полезным и гибким. Одна из основных проблем - отсутствие конкретного графического интерфейса пользователя, который может сделать взаимодействие с алгоритмами обработки утомительным.

В дополнение к программному обеспечению, основанному на традиционных настольных компьютерах, доступны приложения для устройств Android и iOS для полуавтоматического и автоматического подсчета колоний. Встроенная камера используется для фотографирования чашки с агаром, а внутренний или внешний алгоритм используется для обработки данных изображения и оценки количества колоний. [14] [15] [16] [17]

Автоматизированные системы [ править ]

Многие из автоматизированных систем используются для противодействия человеческой ошибке, поскольку многие методы исследования, выполняемые людьми, подсчитывающими отдельные клетки, имеют высокую вероятность ошибки. Из-за того, что исследователи регулярно вручную подсчитывают клетки с помощью проходящего света, этот метод, подверженный ошибкам, может существенно повлиять на расчетную концентрацию в основной жидкой среде, когда количество клеток мало.

Автоматический счетчик колоний с использованием обработки изображений.

Полностью автоматизированные системы также доступны от некоторых производителей биотехнологии. [18] [19] Как правило, они дороги и не так гибки, как автономное программное обеспечение, поскольку оборудование и программное обеспечение предназначены для совместной работы в определенных условиях. [ необходима цитата ] В качестве альтернативы, некоторые автоматические системы используют парадигму спирального покрытия . [ необходима цитата ]

Некоторые автоматизированные системы, такие как системы MATLAB, позволяют подсчитывать клетки без необходимости их окрашивания. Это позволяет повторно использовать колонии для других экспериментов без риска уничтожения микроорганизмов пятнами. Однако недостатком этих автоматизированных систем является то, что чрезвычайно трудно отличить микроорганизмы с пылью или царапинами на пластинах с кровяным агаром, потому что и пыль, и царапины могут создавать самые разнообразные комбинации форм и внешнего вида. [20]

Альтернативные единицы [ править ]

Вместо колониеобразующих единиц можно использовать параметры наиболее вероятного числа (MPN) и модифицированных единиц Фишмана (MFU) [ необходима ссылка ] . Метод наиболее вероятного числа подсчитывает жизнеспособные клетки и полезен при подсчете низких концентраций клеток или подсчете микробов в продуктах, в которых наличие твердых частиц делает подсчет на чашке нецелесообразным. [21] В модифицированных единицах Фишмана учитываются жизнеспособные, но не культивируемые бактерии. [ необходима цитата ]

См. Также [ править ]

  • Подсчет клеток
  • Среда для выращивания
  • Метод Майлза и Мисры
  • Наиболее вероятное число
  • Покрытие реплики
  • Вирусный налет

Ссылки [ править ]

  1. ^ Гольдман, Эмануэль; Грин, Лорренс Х (24 августа 2008 г.). Практическое руководство по микробиологии, второе издание (электронная книга Google) (второе изд.). США: CRC Press, Taylor and Francis Group. п. 864. ISBN 978-0-8493-9365-5. Проверено 16 октября 2014 .
  2. ^ Порода RS, Dotterrer WD (май 1916). «Число колоний, допустимых на удовлетворительных чашках с агаром» . Журнал бактериологии . 1 (3): 321–31. DOI : 10.1128 / JB.1.3.321-331.1916 . PMC 378655 . PMID 16558698 .  
  3. ^ Schug, Angela R .; Бартель, Александр; Мерер, Марита; Scholtzek, Anissa D .; Бромбах, Джулиан; Хенсель, Вивиан; Фаннинг, Саймус; Шварц, Стефан; Фесслер, Андреа Т. (01.12.2020). «Сравнение двух методов определения количества клеток в ходе тестирования чувствительности к биоцидам» . Ветеринарная микробиология . 251 : 108831. дои : 10.1016 / j.vetmic.2020.108831 .
  4. ^ «Log10 колониеобразующих единиц на грамм» . Энциклопедия Тити Тудоранча . Проверено 25 сентября 2016 года .
  5. ^ Daniel YC Fung (2009). «Количество жизнеспособных клеток» . Bioscience International . Проверено 25 сентября 2016 года .
  6. ↑ Мартин Коул (1 ноября 2005 г.). «Принципы микробиологического тестирования: статистические основы отбора проб» (PDF) . Международная комиссия по микробиологическим спецификациям пищевых продуктов (ICMSF). Архивировано из оригинального (PDF) 31 октября 2017 года . Проверено 25 сентября 2016 года .
  7. ^ a b c «Фармакопея США 61: Подсчет микроорганизмов» (PDF) . Фармакопея США . Проверено 24 марта 2015 года . [ постоянная мертвая ссылка ]
  8. ^ Рейнольдс, Джеки. «Протоколы последовательного разбавления» . www.microbelibrary.org . Архивировано из оригинала на 2015-11-17 . Проверено 15 ноября 2015 .
  9. ^ Geissmann Q (2013). «OpenCFU, новое бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для подсчета колоний клеток и других круглых объектов» . PLOS ONE . 8 (2): e54072. DOI : 10.1371 / journal.pone.0054072 . PMC 3574151 . PMID 23457446 .  
  10. ^ https://www.nist.gov/pml/div686/sources_detectors/nice.cfm [ требуется полная ссылка ]
  11. ^ Кларк ML, Burton RL, Хилл Н., Litorja M, Нама MH, Hwang J (август 2010). «Недорогой, высокопроизводительный, автоматизированный подсчет колоний бактерий» . Цитометрии Часть A . 77 (8): 790–7. DOI : 10.1002 / cyto.a.20864 . PMC 2909336 . PMID 20140968 .  
  12. Перейти ↑ Cai Z, Chattopadhyay N, Liu WJ, Chan C, Pignol JP, Reilly RM (ноябрь 2011 г.). «Оптимизированный цифровой подсчет колоний в клоногенных анализах с использованием программного обеспечения ImageJ и настраиваемых макросов: сравнение с ручным подсчетом». Международный журнал радиационной биологии . 87 (11): 1135–46. DOI : 10.3109 / 09553002.2011.622033 . PMID 21913819 . S2CID 25417288 .  
  13. ^ Vokes MS, Карпентер AE (апрель 2008). Использование CellProfiler для автоматической идентификации и измерения биологических объектов на изображениях . Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 14. С. Раздел 14.17. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb1417s82 . ISBN 978-0471142720. PMC  4302752 . PMID  18425761 .
  14. ^ "Счетчик колоний Промега" . Магазин приложений . Проверено 28 сентября 2018 .
  15. ^ "APD Colony Counter App PRO - Приложения в Google Play" . play.google.com . Проверено 28 сентября 2018 .
  16. ^ Austerjost, Йонас; Марквард, Даниэль; Раддац, Лукас; Гейер, Доминик; Беккер, Томас; Шепер, Томас; Линднер, Патрик; Бейтель, Саша (август 2017 г.). «Приложение для интеллектуального устройства для автоматического определения колоний E. coli на чашках с агаром» . Инженерия в науках о жизни . 17 (8): 959–966. DOI : 10.1002 / elsc.201700056 . ISSN 1618-0240 . PMC 6999497 . PMID 32624845 .   
  17. ^ "Объем КОЕ" . Магазин приложений . Проверено 28 сентября 2018 .
  18. ^ "Счетчики колоний: Роботизированный счетчик колоний - манипулятор" . www.neutecgroup.com . Проверено 28 сентября 2018 .
  19. ^ "Полностью автоматический счетчик колоний от AAA Lab Equipment Video | LabTube" . www.labtube.tv . Проверено 28 сентября 2018 .
  20. ^ Brugger, Silvio D .; Баумбергер, Кристиан; Йост, Марсель; Дженни, Вернер; Brugger, Urs; Мюлеманн, Катрин (2012-03-20). «Автоматический подсчет бактериальных колониеобразующих единиц на чашках с агаром» . PLOS ONE . 7 (3): e33695. DOI : 10.1371 / journal.pone.0033695 . ISSN 1932-6203 . PMC 3308999 . PMID 22448267 .   
  21. ^ «Бактериальное аналитическое руководство: наиболее вероятное число от серийных разведений» . США пищевых продуктов и медикаментов . Октябрь 2010 г.

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Фишман, Уильям Х .; Бернфельд, Питер (1955). [31] Глюкуронидазы . Методы в энзимологии . 1 . стр.  262 -9. DOI : 10.1016 / 0076-6879 (55) 01035-5 . ISBN 978-0-12-181801-2.