Восточное блота или восточный блоттинг , является биохимическим методом , используемым для анализа белков поста-трансляционной модификации , включая добавление липидов, фосфаты, и гликоконъюгаты. Чаще всего используется для обнаружения углеводных эпитопов . Таким образом, вестерн-блоттинг можно рассматривать как продолжение биохимического метода вестерн-блоттинга . Термин «вестерн-блоттинг» описал множество методов, в большинстве случаев используется блоттинг белка проспо, полученного методом электрофореза в геле с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) на поливинилиденфторид или нитроцеллюлозу.мембрана. Перенесенные белки анализируются на предмет посттрансляционных модификаций с использованием зондов, которые могут обнаруживать липиды , углеводы , фосфорилирование или любую другую модификацию белка. Истерн-блоттинг следует использовать для обозначения методов, которые обнаруживают свои мишени посредством специфического взаимодействия посттрансляционных модификаций и зонда, что отличает их от стандартного дальневосточного блоттинга . В принципе, восточный блоттинг аналогичен лектиновому блоттингу (т. Е. Обнаружению углеводных эпитопов на белках или липидах). [1]
История и множество определений
Определение термина " вестерн-блоттинг" несколько запутано из-за того, что несколько групп авторов называют новый метод " восточным блоттингом" или его производным. Все определения являются производными от техники вестерн-блоттинга, разработанной Towbin в 1979 году. [2] Текущие определения приведены ниже в порядке первого использования имени; однако все они основаны на более ранних работах. В некоторых случаях этот метод применялся на практике в течение некоторого времени до введения этого термина.
- (1982) Термин « восточный блоттинг» был специально отвергнут двумя отдельными группами: Рейнхарт и Маламуд назвали белковый блот нативного геля нативным блоттингом ; [3] Peferoen et al. Решили сослаться на свой метод нанесения белков, разделенных гелем додецилсуфата натрия, на нитроцеллюлозу с использованием вакуума, как на вакуумный блоттинг . [4] [5]
- (1984) Ближневосточный блоттинг описан как блоттинг полиА РНК (разделенной агарозой), которую затем иммобилизуют. Затем иммобилизованную РНК исследуют с помощью ДНК. [6]
- (1996) Восточно-вестерн-блоттинг впервые был использован Богдановым и соавт. [7] Метод включал блоттинг фосфолипидов на мембране из поливинилиденфторида или нитроцеллюлозы перед переносом белков на ту же нитроцеллюлозную мембрану обычным вестерн-блоттингом и зондированием конформационно-специфическими антителами. Этот метод основан на более ранней работе Taki et al. в 1994 году, который они первоначально назвали ТСХ-блоттингом , [8] и был основан на аналогичном методе, введенном Тобином в 1984 году [9].
- (2000) Дальневосточная блоттинг, кажется, была впервые названа в 2000 году Исикавой и Таки. [10] Метод более подробно описан в статье о дальневосточном блоте , но основан на окрашивании липидов, перенесенных на поливинилиденфторидные мембраны, на антитела или лектин.
- (2001) Истерн-блоттинг был описан как метод обнаружения гликоконъюгатов, образующихся при блоттинге BSA на поливинилиденфторидных мембранах с последующей обработкой периодатом. Затем окисленный белок обрабатывают сложной смесью, образуя новый конъюгат на мембране. Затем мембрану исследуют антителами на предмет интересующих эпитопов. [11] Этот метод также обсуждался в более поздних работах той же группы. [12] [13] По сути, метод дальневосточного блоттинга. [14]
- (2002) Истерн-блот также использовался для описания иммуноблоттинга белков, перенесенных на поливинилиденфторидную мембрану из прогона с гелем PAGE с противоположной полярностью. [15] Так как это, по сути, вестерн-блоттинг , перестановка заряда использовалась, чтобы окрестить этот метод вестерн-блоттингом . [16] [17]
- (2005) Истерн-блот был использован для описания блоттинга белков на поливинилиденфторидной мембране, где зонд представляет собой аптамер, а не антитело. [18] Это можно рассматривать как аналог Саузерн-блоттинга , однако взаимодействие происходит между молекулой ДНК (аптамер) и белком, а не двумя молекулами ДНК. [19] Метод аналогичен юго-западному блоттингу .
- (2006) Истерн-блоттинг использовался для обозначения обнаружения слитых белков посредством комплементации. Название основано на использовании активатора фермента (EA) как части обнаружения. [20] [21] [22]
- (2009) Истерн-блоттинг совсем недавно был переименован Thomas et al. как метод, который исследует белки, нанесенные на поливинилиденфторидную мембрану, с помощью лектинов, холерного токсина и химических красителей для обнаружения гликозилированных, липоилированных или фосфорилированных белков. [14] Эти авторы отличают метод от дальневосточного блоттинга, названного Taki et al. [10] в том, что они используют лектиновые зонды и другие окрашивающие реагенты.
- (2009) Истерн-блот был использован для описания блоттинга белков на нитроцеллюлозной мембране, где зонд представляет собой аптамер, а не антитело. [23] Метод аналогичен юго-западному блоттингу.
- (2011) В недавнем исследовании использовался термин «восточный блоттинг» для описания обнаружения гликопротеинов с помощью лектинов, таких как конканавалин A [24]
Однозначно не существует единого общепринятого определения этого термина. В недавней обзорной статье [25] было взято интервью у Эда Саузерна , создателя Саузерн-блоттинга , по поводу перекрестного определения восточного блоттинга из Tanaka et al. [12] В статье восточное пятно сравнивается с «феями, единорогами и бесплатным обедом» и утверждается, что восточных пятен «не существует». Восточный блот упоминается в учебнике иммунологии, в котором сравниваются распространенные методы блоттинга (южный, северный и западный), и утверждается, что «восточный блоттинг, однако, существует только в тестовых вопросах». [26]
Принципы, используемые для восточного блоттинга для обнаружения гликанов, можно проследить до использования лектинов для обнаружения гликозилирования белков . Самым ранним примером этого метода обнаружения является Таннер и Ансти в 1976 году, когда лектины использовались для обнаружения гликозилированных белков, выделенных из эритроцитов человека . [27] Специфическое определение гликозилирования с помощью блоттинга обычно называется лектиновым блоттингом . Краткое изложение последних улучшений протокола было предоставлено Х. Фризом. [1]
Приложения
Одно из применений метода включает обнаружение модификаций белков у двух видов бактерий Ehrlichia - E. muris и IOE. Субъединица холерного токсина B (которая связывается с ганглиозидами ), конканавалин A (который обнаруживает маннозу-содержащие гликаны) и нитрофосфомолибдат-метиловый зеленый (который обнаруживает фосфопротеины) были использованы для обнаружения модификаций белка. Этот метод показал, что антигенные белки невирулентного E.muris более посттрансляционно модифицированы, чем высоковирулентный ИОЕ. [14]
Значимость
Большинство белков , которые транслируются с мРНК, претерпевают модификации, прежде чем стать функциональными в клетках. Эти модификации известны как посттрансляционные модификации . Образующиеся или свернутые белки, которые стабильны в физиологических условиях, затем подвергаются ряду специфических катализируемых ферментами модификаций на боковых цепях или скелете.
Посттрансляционная модификация белков может включать в себя ацетилирование , ацилирование ( миристоилирование , пальмитоилирование ), алкилирование , аргинилирование , АДФ-рибозилирование , биотинилирование , формилирование , geranylgeranylation , glutamylation , гликозилирование , glycylation , гидроксилирование , isoprenylation , lipoylation , метилирование , nitroalkylation , phosphopantetheinylation , фосфорилирование , пренилирование , селенирование , S-нитрозилирование , сукцинилирование , сульфатирование , трансглютаминирование , сульфинилирование , сульфонилирование и убиквитинирование (сумоилирование, неддилирование). [28] [29]
Посттрансляционные модификации , происходящие на N-конце в аминокислотной цепи играют важную роль в транслокации через биологические мембраны. К ним относятся секреторные белки прокариот и эукариот, а также белки, которые предназначены для включения в различные мембраны клеток и органелл, такие как лизосомы , хлоропласты , митохондрии и плазматические мембраны . Экспрессия посттранслируемых белков важна при нескольких заболеваниях.
Смотрите также
- Северо-западное пятно
Рекомендации
- ^ a b Freeze, HH (1993). «Приготовление и анализ гликоконъюгатов». Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 17: 17.7.1–17.7.8. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb1707s23 . PMID 18265163 . S2CID 205153650 .
- ^ Towbin; Стахелин, Т; Гордон, Дж; и другие. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: методика и некоторые применения» . PNAS . 76 (9): 4350–4. DOI : 10.1073 / pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID 388439 .
- ^ Рейнхарт и Маламуд; Маламуд, Д. (1982). «Перенос белка из изоэлектрических фокусирующих гелей: нативный блот». Аналитическая биохимия . 123 (2): 229–235. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (82) 90439-0 . PMID 6181706 .
- ^ Пефероэн; и другие. (1982). «Вакуум-блоттинг: новый простой и эффективный перенос белков из полиакриламидных гелей додецилсульфата натрия в нитроцеллюлозу» . Письма FEBS . 145 (2): 369–372. DOI : 10.1016 / 0014-5793 (82) 80202-0 . S2CID 85394990 .
- ^ Рокко, Р.М., изд. (2005). Основные статьи по клинической химии . п. 385 . ISBN 978-0-444-51950-4.
- ^ Wreschner, DH; Герцберг, М. (1984). «Новая среда для блоттинга для простого выделения и идентификации матричной РНК с высоким разрешением» . Исследования нуклеиновых кислот . 12 (3): 1349–1359. DOI : 10.1093 / NAR / 12.3.1349 . PMC 318581 . PMID 6701087 .
- ^ Богданов; Вс, Дж; Кабак, HR; Даухан, Вт; и другие. (1996). «Фосфолипид действует как шаперон в сборке мембранного транспортного белка» . Журнал биологической химии . 271 (20): 11615–11618. DOI : 10.1074 / jbc.271.20.11615 . PMID 8662750 .
- ^ Таки; Handa, S; Ishikawa, D; и другие. (1994). «Блоттинг гликолипидов и фосфолипидов с высокоэффективной тонкослойной хроматограммы на поливинилидендифторидную мембрану». Аналитическая биохимия . 221 (2): 312–316. DOI : 10.1006 / abio.1994.1418 . PMID 7810872 .
- ^ Towbin; Schoenenberger, C; Ball, R; Браун, Д.Г.; Розенфельдер, G; и другие. (1984). «Гликосфинголипид-блоттинг: процедура иммунологического обнаружения после разделения с помощью тонкослойной хроматографии». Журнал иммунологических методов . 72 (2): 471–9. DOI : 10.1016 / 0022-1759 (84) 90015-2 . PMID 6381603 .
- ^ а б Исикава и Таки; Таки, Т (2000). Тонкослойный блоттинг с использованием поливинилидендифторидной мембраны (дальневосточный блоттинг) и его применение . Методы в энзимологии . 312 . С. 145–57. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (00) 12905-2 . ISBN 9780121822132. PMID 11070868 .
- ^ Шан; Танака, Н; Шояма, Й; и другие. (2001). «Иммуноферментный анализ глицирризина с использованием моноклональных антител против глицирризина и нового восточного блоттинга для глюкуронидов глицирретиновой кислоты». Аналитическая химия . 73 (24): 5784–90. DOI : 10.1021 / ac0106997 . PMID 11791545 .
- ^ а б Танака; Fukuda, N; Шояма, Й; и другие. (2007). «Восточный блоттинг и концентрация иммуноаффинности с использованием моноклональных антител к сапонинам женьшеня в области традиционной китайской медицины». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии . 55 (10): 3783–7. DOI : 10.1021 / jf063457m . PMID 17455950 .
- ^ Фукуда; Шань, Шаоцзе; Танака, Хироюки; Сояма, Юкихиро; и другие. (2006). «Новая методология окрашивания: Восточный блоттинг на гликозиды в области лекарств Кампо». Журнал натуральных лекарств . 60 : 21–27. DOI : 10.1007 / s11418-005-0005-3 . S2CID 44234050 .
- ^ а б в Томас; Тирумалапура, N; Кроссли, ЕС; Исмаил, N; Уокер, DH; и другие. (2009). «Модификации антигенных белков у Эрлихии» . Иммунология паразитов . 31 (6): 296–303. DOI : 10.1111 / j.1365-3024.2009.01099.x . PMC 2731653 . PMID 19493209 .
- ^ Буксбаум; и другие. (2002). «Катионный электрофорез и электроперенос мембранных гликопротеинов». Аналитическая биохимия . 314 (1): 70–76. DOI : 10.1016 / S0003-2697 (02) 00639-5 . PMID 12633604 .
- ^ Куриен и Скофилд; Скофилд, Р.Х. (2006). «Вестерн-блоттинг». Методы . 38 (4): 283–293. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2005.11.007 . PMID 16483794 .
- ^ Буксбаум (2009). «Катионный электрофорез и Восточный блоттинг». Блоттинг и обнаружение белков . Методы молекулярной биологии. 536 . С. 115–128. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-542-8_14 . ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378051 .
- ^ Лека-Бувье и Блюм; Блюм, Лоик (2005). «Биосенсоры для обнаружения белков: обзор». Аналитические письма . 38 (10): 1491. DOI : 10,1081 / АЛ-200065780 . S2CID 94503772 .
- ^ Джаясена (1999). «Аптамеры: новый класс молекул, которые конкурируют с антителами в диагностике» . Клиническая химия . 45 (9): 1628–1650. DOI : 10.1093 / clinchem / 45.9.1628 . PMID 10471678 .
- ^ Горецка; Устав, NW; Bosano, BL; Fung, P; Кобель, П; Peng, K; Eglen, RM; и другие. (2006). «Новый метод без антител для блоттинга белков с использованием комплементации фрагментов ферментов» . Биотехнологии . 40 (3): 381–383. DOI : 10.2144 / 000112119 . PMID 16568826 .
- ^ Олсон и Эглен; Эглен, РМ (2007). «Комплементация бета-галактозидазы: платформа для клеточного люминесцентного анализа для открытия лекарств». АНАЛИЗ и технологии разработки лекарств . 5 (1): 137–144. DOI : 10.1089 / adt.2006.052 . PMID 17355206 .
- ↑ Коммерчески доступные наборы для восточного блоттинга. Архивировано 5 сентября 2009 г. в Wayback Machine.
- ^ Лин и МакНатти; Лин, JS (2009). «Регионально защищенная ПЦР на основе аптамеров для обнаружения белков» . Клиническая химия . 55 (9): 1687–1693. DOI : 10,1373 / clinchem.2009.127266 . PMID 19589846 .
- ^ Mariappa D, Sauert K, Mariño K, Turnock D, Webster R, van Aalten DM, Ferguson MA, Müller HA. O-GlcNAцилирование белка необходимо для передачи сигналов фактора роста фибробластов в Drosophila.Sci Signal. 2011 20 декабря; 4 (204) ра89. http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/pdf/nesthocker.pdf
- ^ Восточная клякса на пейзаже
- ^ Луттман, Братке и Куппер (2006). Иммунология . Академическая пресса. п. 11. ISBN 978-0-12-088544-2.
- ^ Таннер, MJ; Ансти, ди-джей (1976). «Метод прямой демонстрации лектин-связывающих компонентов мембраны эритроцитов человека» . Биохимический журнал . 153 (2): 265–270. DOI : 10.1042 / bj1530265 . PMC 1172571 . PMID 1275889 .
- ^ Манн, М; Дженсен, О.Н. (2003). «Протеомный анализ посттрансляционных модификаций». Природа Биотехнологии . 21 (3): 255–261. DOI : 10.1038 / nbt0303-255 . PMID 12610572 . S2CID 205266061 .
- ^ Уолш, Коннектикут; Гарно-Цодикова, С ; Гатто, Дж. Дж. Младший (2005). «Посттрансляционные модификации белков: химия диверсификации протеома». Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 44 (45): 7342–7372. DOI : 10.1002 / anie.200501023 . PMID 16267872 .