Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Спектрофотометр Beckman DU640 UV / Vis

Ферментные анализы - это лабораторные методы измерения ферментативной активности. Они жизненно важны для изучения кинетики ферментативных и ингибирования фермента .

Ферментные единицы [ править ]

Количество или концентрация фермента может быть выражена в молярных количествах, как в случае любого другого химического вещества, или в единицах активности фермента .

Ферментная активность [ править ]

Активность фермента = количество молей субстрата, преобразованных в единицу времени = скорость × реакционный объем. Ферментная активность - это мера количества присутствующего активного фермента и, таким образом, зависит от условий, которые следует указать . Единица СИ - катал , 1 катал = 1 моль с -1 , но это слишком большая единица. Более практичным и обычно используемым значением является ферментная единица (U) = 1 мкмоль мин -1 . 1 U соответствует 16.67 нанокаталю . [1]

Активность фермента, указанная в катал, обычно относится к предполагаемой природной целевой субстрат фермента. Ферментативная активность также может быть выражена как активность некоторых стандартизованных субстратов, таких как желатин , затем измеряется в единицах переваривания желатина (GDU), или в белках молока, а затем измеряется в единицах свертывания молока (MCU). Единицы GDU и MCU основаны на том, насколько быстро один грамм фермента переваривает желатин или молочные белки соответственно. 1 GDU примерно равен 1,5 MCU. [2]

Увеличенное количество субстрата увеличит скорость реакции с ферментами, однако после определенного момента скорость реакции выровняется, поскольку количество доступных активных центров остается постоянным.

Конкретная деятельность [ править ]

Удельная активность фермента - еще одна общая единица. Это активность фермента на миллиграмм общего белка (выраженная в мкмоль мин -1 мг -1 ). Удельная активность позволяет определить чистоту фермента в смеси. Это микромоль продукта, образованного ферментом за заданный промежуток времени (минуты) при заданных условиях на миллиграмм общего количества белков. Удельная активность равна скорости реакции, умноженной на объем реакции, деленный на массу общего белка. Единица СИ - катал / кг, но более практичной единицей является мкмоль / мгмин.

Удельная активность - это мера процессивности фермента (способность фермента обрабатываться) при определенной (обычно насыщающей) концентрации субстрата и обычно является постоянной для чистого фермента.

Процесс титрования активного центра может быть выполнен для исключения ошибок, возникающих из-за различий в партиях культивирования и / или неправильно свернутого фермента и аналогичных проблем. Это мера количества активного фермента, рассчитанная, например, путем титрования количества присутствующих активных центров с использованием необратимого ингибитора. Затем следует выразить удельную активность в мкмоль мин -1 мг -1 активного фермента. Если молекулярная масса фермента известна, число оборотов или мкмоль продукта в секунду на мкмоль активного фермента можно рассчитать по удельной активности. Число оборотов можно представить как количество раз, которое каждая молекула фермента выполняет свой каталитический цикл в секунду.

Связанная терминология [ править ]

Скорость реакции представляет концентрацию субстрата (или исчезновения продукта производства) в единицу времени (моль L -1 с -1 ).

Чистота% 100% × (удельная активность фермента образца / специфической активности чистого фермента). Неочищенный образец имеет более низкую удельную активность, потому что часть массы на самом деле не является ферментом. Если известна удельная активность 100% чистого фермента, то нечистый образец будет иметь более низкую удельную активность, что позволяет рассчитать чистоту и затем получить четкий результат.

Типы анализов [ править ]

Во всех ферментных анализах измеряется либо потребление субстрата, либо производство продукта с течением времени. [3] Существует большое количество различных методов измерения концентраций субстратов и продуктов, и многие ферменты можно анализировать различными способами. Биохимики обычно изучают катализируемые ферментами реакции, используя четыре типа экспериментов: [4]

  • Эксперименты с начальной скоростью . Когда фермент смешивается с большим избытком субстрата, промежуточное соединение фермент-субстрат накапливается с быстрым начальным переходным процессом. [3] Затем реакция достигает установившейся кинетики, при которой промежуточные соединения субстрата фермента остаются примерно постоянными с течением времени, а скорость реакции изменяется относительно медленно. Скорости измеряются в течение короткого периода времени после достижения квазистационарного состояния, обычно путем мониторинга накопления продукта с течением времени. Поскольку измерения проводятся в течение очень короткого периода времени и из-за большого избытка подложки, можно сделать приближение, что количество свободной подложки приблизительно равно количеству исходной подложки. [5] [6]Эксперимент с начальной скоростью является самым простым для выполнения и анализа, поскольку он относительно свободен от таких осложнений, как обратная реакция и разложение ферментов. Поэтому это, безусловно, наиболее часто используемый тип экспериментов по кинетике ферментов.
  • Кривая прогресса экспериментов . В этих экспериментах кинетические параметры определяются из выражений для концентраций компонентов как функции времени. Концентрация субстрата или продукта регистрируется во времени после начального быстрого переходного процесса и в течение достаточно длительного периода, чтобы позволить реакции приблизиться к равновесию. Эксперименты с кривой прогресса широко использовались на раннем этапе изучения кинетики ферментов, но сейчас они менее распространены.
  • Эксперименты по переходной кинетике . В этих экспериментах поведение реакции отслеживается во время начального быстрого переходного процесса, когда промежуточный продукт достигает установившегося периода кинетики. Эти эксперименты труднее выполнить, чем любой из двух вышеупомянутых классов, поскольку они требуют специальных методов (таких как мгновенный фотолиз заключенных в клетки соединений) или быстрого перемешивания (например, остановленного потока , остановленного потока или непрерывного потока).
  • Релаксационные эксперименты . В этих экспериментах равновесная смесь фермента, субстрата и продукта нарушается, например, из-за скачка температуры , давления или pH, и отслеживается возврат к равновесию. Анализ этих экспериментов требует рассмотрения полностью обратимой реакции. Более того, эксперименты по релаксации относительно нечувствительны к механистическим деталям и поэтому обычно не используются для идентификации механизма, хотя могут проводиться в соответствующих условиях.

Ферментные анализы можно разделить на две группы в соответствии с их методом отбора проб: непрерывные анализы , где анализ дает непрерывное считывание активности, и периодические анализы , когда отбираются пробы, реакция останавливается, а затем определяется концентрация субстратов / продуктов.

Держатель кювет с регулируемой температурой в спектрофотометре.

Непрерывные анализы [ править ]

Наиболее удобны непрерывные анализы, при которых один анализ дает скорость реакции без дополнительной работы. Есть много различных типов непрерывных анализов.

Спектрофотометрический [ править ]

В спектрофотометрических анализах вы отслеживаете ход реакции, измеряя изменение количества света, поглощаемого аналитическим раствором. Если этот свет находится в видимой области, вы действительно можете увидеть изменение цвета анализа, и это называется колориметрическим анализом . Анализ МТТ , окислительно - восстановительный анализ с использованием красителя тетразолии в качестве субстрата является примером колориметрического анализа.

Часто используется УФ-свет, поскольку обычные коферменты НАДН и НАДФН поглощают УФ-свет в их восстановленных формах, но не в их окисленных формах. Таким образом, оксидоредуктаза, использующая НАДН в качестве субстрата, может быть проанализирована по уменьшению УФ-поглощения на длине волны 340 нм по мере того, как она потребляет кофермент. [7]

Сравнение прямого и связанного анализов

Сопряженный анализ гексокиназы с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы .

Даже если ферментативная реакция не приводит к изменению поглощения света, все еще можно использовать спектрофотометрический анализ фермента с использованием комбинированного анализа . Здесь продукт одной реакции используется как субстрат другой, легко обнаруживаемой реакции. Например, на рисунке 1 показан сопряженный анализ фермента гексокиназы , который может быть проанализирован путем связывания выработки глюкозо-6-фосфата с производством НАДФН с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы .

Флуорометрия [ править ]

Флуоресценция - это когда молекула излучает свет с одной длиной волны после поглощения света с другой длиной волны. Флуорометрические анализы используют разницу во флуоресценции субстрата от продукта для измерения ферментативной реакции. Эти анализы в целом намного более чувствительны, чем спектрофотометрические анализы, но могут страдать от помех, вызванных примесями и нестабильностью многих флуоресцентных соединений при воздействии света.

Примером этих анализов снова является использование нуклеотидных коферментов НАДН и НАДФН. Здесь восстановленные формы являются флуоресцентными, а окисленные формы нефлуоресцентными. Поэтому реакции окисления могут сопровождаться уменьшением флуоресценции, а реакции восстановления - увеличением. [8] Также доступны синтетические субстраты, которые выделяют флуоресцентный краситель в реакции, катализируемой ферментами, например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид для анализа β-галактозидазы или 4-метилумбеллиферилбутират для анализа липазы Candida rugosa . [9]

Калориметрический [ править ]

Хемилюминесценция люминола

Калориметрия - это измерение тепла, выделяемого или поглощаемого химическими реакциями. Эти анализы являются очень общими, так как многие реакции включают некоторое изменение тепла, а при использовании микрокалориметра не требуется много фермента или субстрата. Эти анализы можно использовать для измерения реакций, которые невозможно проанализировать никаким другим способом. [10]

Хемилюминесцентный [ править ]

Хемилюминесценция - это испускание света в результате химической реакции. Некоторые ферментативные реакции производят свет, и его можно измерить, чтобы обнаружить образование продукта. Эти типы анализов могут быть чрезвычайно чувствительными, поскольку производимый свет может улавливаться фотографической пленкой в ​​течение нескольких дней или недель, но их трудно определить количественно, потому что не весь свет, испускаемый реакцией, будет обнаружен.

Обнаружение пероксидазы хрена с помощью ферментативной хемилюминесценции (ECL) является распространенным методом обнаружения антител при вестерн-блоттинге . Другой пример - фермент люцифераза , он содержится в светлячках и, естественно, производит свет из своего субстрата люциферина.

Рассеяние света [ править ]

Статическое рассеяние света измеряет произведение средневзвешенной молярной массы и концентрации макромолекул в растворе. Учитывая фиксированную общую концентрацию одного или нескольких веществ в течение времени измерения, сигнал рассеяния является прямой мерой усредненной по массе молярной массы раствора, которая будет изменяться при образовании или диссоциации комплексов. Следовательно, измерение количественно определяет стехиометрию комплексов, а также кинетику. Анализ кинетики белков с помощью светорассеяния - это очень общий метод, для которого не требуется фермент.

Микромасштабный термофорез [ править ]

Микромасштабный термофорез (MST) [11] измеряет размер, заряд и энтропию гидратации молекул / субстратов в равновесии. [12] Термофоретическое движение флуоресцентно меченого субстрата значительно изменяется, когда он модифицируется ферментом. Эту ферментативную активность можно измерить с высоким временным разрешением в реальном времени. [13] Расход материала полностью оптического метода MST очень низок, для измерения ферментативных констант скорости активности и ингибирования необходимы только 5 мкл объема образца и концентрация фермента 10 нМ. MST позволяет аналитикам одновременно измерять модификацию двух разных подложек ( мультиплексирование), если оба субстрата помечены разными флуорофорами. Таким образом можно проводить эксперименты по конкуренции субстратов.

Прерывистые анализы [ править ]

Прерывистые анализы - это когда образцы берут из ферментной реакции через определенные промежутки времени, и в этих образцах измеряется количество продукции или потребление субстрата.

Радиометрический [ править ]

Радиометрические тесты измеряют включение радиоактивности в субстраты или ее высвобождение из субстратов. Эти радиоактивные изотопы , наиболее часто используемые в этих анализах в 14 C, 32 P, 35 S и 125 I. Так как радиоактивные изотопы могут позволить специфическую маркировку одного атома субстрата, эти анализы являются очень чувствительными и специфичными. Они часто используются в биохимии и часто являются единственным способом измерения конкретной реакции в неочищенных экстрактах (сложных смесях ферментов, образующихся при лизисе клеток).

Радиоактивность обычно измеряется в этих процедурах с помощью сцинтилляционного счетчика .

Хроматографический [ править ]

Хроматографические анализы определяют образование продукта путем разделения реакционной смеси на ее компоненты с помощью хроматографии . Обычно это делается с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но также можно использовать более простой метод тонкослойной хроматографии . Хотя для этого подхода может потребоваться много материала, его чувствительность можно повысить, пометив субстраты / продукты радиоактивной или флуоресцентной меткой. Чувствительность анализа также была увеличена за счет переключения протоколов на улучшенные хроматографические инструменты (например, жидкостная хроматография сверхвысокого давления), которые работают при давлении насоса в несколько раз выше, чем инструменты для ВЭЖХ (см. Высокоэффективная жидкостная хроматография # Давление насоса ). [14]

Факторы, которые необходимо контролировать в анализах [ править ]

Камера давления для измерения активности ферментов при высоком давлении.

На результат анализа влияют несколько факторов, и в недавнем обзоре суммированы различные параметры, которые необходимо контролировать, чтобы анализ продолжал работать. [15]

  • Концентрация соли : большинство ферментов не переносят чрезвычайно высокие концентрации соли. Ионы мешают слабых ионных связей с белками . Типичные ферменты активны при концентрации соли 1-500 мМ. Как обычно, есть исключения, такие как галофильные водоросли и бактерии .
  • Влияние температуры : все ферменты работают в диапазоне температур, специфичных для организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции. У увеличения есть предел, потому что более высокие температуры приводят к резкому снижению скорости реакции. Это происходит из-за денатурации (изменения) структуры белка в результате разрушения слабых ионных и водородных связей, которые стабилизируют трехмерную структуру активного центра фермента. [16] «Оптимальная» температура для ферментов человека обычно составляет от 35 до 40 ° C. Средняя температура для человека 37 ° C. Ферменты человека начинают быстро денатурировать при температуре выше 40 ° C. Ферменты из термофильных Археи, обнаруженные в горячих источниках, стабильны до 100 ° C. [17] Однако идея «оптимальной» скорости ферментативной реакции вводит в заблуждение, поскольку скорость, наблюдаемая при любой температуре, является произведением двух скоростей: скорости реакции и скорости денатурации. Если бы вы использовали анализ, измеряющий активность в течение одной секунды, он дал бы высокую активность при высоких температурах, однако, если бы вы использовали анализ, измеряющий образование продукта в течение часа, он дал бы вам низкую активность при этих температурах.
  • Влияние pH : большинство ферментов чувствительны к pH и имеют определенные диапазоны активности. Все имеют оптимальный pH. PH может остановить активность фермента, денатурируя (изменяя) трехмерную форму фермента, разрывая ионные и водородные связи . Большинство ферментов функционируют при pH от 6 до 8; однако пепсин в желудке лучше всего работает при pH 2, а трипсин - при pH 8.
  • Насыщение субстрата : увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции (активность фермента). Однако насыщение ферментами ограничивает скорость реакции. Фермент насыщен, когда активные центры всех молекул заняты большую часть времени. В точке насыщения реакция не будет ускоряться, сколько бы дополнительного субстрата ни было добавлено. График скорости реакции выйдет на плато.
  • Уровень скученности , большое количество макромолекул в растворе будет изменять скорость и константы равновесия ферментативных реакций за счет эффекта, называемого макромолекулярной скученностью . [18]

Список ферментных анализов [ править ]

  • МТТ анализ
  • Тест наложения
  • Гидролиз диацетата флуоресцеина
  • пара- нитрофенилфосфат

См. Также [ править ]

  • Фермент рестрикции
  • Анализ следа ДНКазы
  • Кинетика ферментов

Ссылки [ править ]

  1. ^ Номенклатурный комитет Международного союза биохимиков (NC-IUB) (1979). «Единицы ферментативной активности». Евро. J. Biochem . 97 (2): 319–20. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1979.tb13116.x .
  2. ^ Сколько? Словарь единиц измерения Расс Роулетт из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл
  3. ^ a b Шринивасан, Бхарат (2020-09-27). «Совет: обучение кинетике ферментов» . Журнал FEBS . DOI : 10.1111 / febs.15537 . ISSN 1742-464X . 
  4. ^ Schnell, S .; Чаппелл, MJ; Evans, ND; Руссель, MR (2006). «Проблема различимости механизма в биохимической кинетике: реакция с одним ферментом и одним субстратом в качестве примера». Comptes Rendus Biologies . 329 (1): 51–61. DOI : 10.1016 / j.crvi.2005.09.005 . PMID 16399643 . 
  5. ^ Srinivasan, Бхарат (2020-10-08). «Явное лечение не Михаэлиса-Ментен и атипичной кинетики в раннем открытии лекарств» . dx.doi.org . Проверено 28 октября 2020 .
  6. ^ Srinivasan, Бхарат (2020-09-27). «Совет: обучение кинетике ферментов» . Журнал FEBS . DOI : 10.1111 / febs.15537 . ISSN 1742-464X . 
  7. ^ Bergmeyer, HU (1974). Методы ферментативного анализа . 4 . Нью-Йорк: Academic Press. С. 2066–72. ISBN 0-89573-236-X.
  8. ^ Пассонно, СП; Лоури, Огайо (1993). Ферментативный анализ. Практическое руководство . Тотова, штат Нью-Джерси: Humana Press. С. 85–110.
  9. ^ Menden, Ariane (26 июля 2019). «Быстрый миниатюрный анализ in vitro, разработанный для количественной оценки активности ферментов липазы» . Журнал ингибирования ферментов и медицинской химии . 34 (1): 1474–1480. DOI : 10.1080 / 14756366.2019.1651312 . PMC 6713963 . PMID 31414611 .  
  10. ^ Todd MJ, Гомес J (сентябрь 2001). «Кинетика ферментов, определенная с помощью калориметрии: общий анализ активности ферментов?». Анальный. Biochem . 296 (2): 179–87. DOI : 10,1006 / abio.2001.5218 . PMID 11554713 . S2CID 18567619 .  
  11. ^ Винкен CJ; и другие. (2010). «Анализы связывания белков в биологических жидкостях с использованием термофореза на микроуровне» . Nature Communications . 1 (7): 100. Bibcode : 2010NatCo ... 1..100W . DOI : 10.1038 / ncomms1093 . PMID 20981028 . 
  12. ^ Duhr S, Braun D (декабрь 2006). «Почему молекулы движутся по температурному градиенту» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 103 (52): 19678–82. Bibcode : 2006PNAS..10319678D . DOI : 10.1073 / pnas.0603873103 . PMC 1750914 . PMID 17164337 .  
  13. ^ Baaske Р, Wienken С, Duhr S (2009). "Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik" [Оптически генерируемый термофорез для биоанализа] (PDF) . Биофотоник (на немецком языке): 22–24.[ постоянная мертвая ссылка ]
  14. ^ Черчвелл, М; Twaddle, N; Микер, L; Дёрге, Д. (октябрь 2005 г.). «Повышение чувствительности в жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии» . Журнал хроматографии B . 825 (2): 134–143. DOI : 10.1016 / j.jchromb.2005.05.037 . PMID 16002352 . 
  15. ^ Srinivasan B, Kantae V, Robinson J, et al. (Апрель 2020 г.). «Воскрешая феникса: когда проба не удалась». Обзоры медицинских исследований . 0 : 0. doi : 10.1002 / med.21670 . hdl : 10289/3552 . PMID 32285494 . 
  16. ^ Дэниел Р.М., Петерсон М.Э., Дэнсон М.Дж. и др. (Январь 2010 г.). «Молекулярные основы влияния температуры на активность ферментов». Biochem. Дж . 425 (2): 353–60. DOI : 10.1042 / BJ20091254 . hdl : 10289/3552 . PMID 19849667 . 
  17. Перейти ↑ Cowan DA (1997). «Термофильные белки: стабильность и функции в водных и органических растворителях». Комп. Biochem. Physiol. Physiol . 118 (3): 429–38. DOI : 10.1016 / S0300-9629 (97) 00004-2 . PMID 9406427 . 
  18. ^ Минтон AP (2001). «Влияние макромолекулярного скопления и макромолекулярного ограничения на биохимические реакции в физиологических средах» . J. Biol. Chem . 276 (14): 10577–80. DOI : 10.1074 / jbc.R100005200 . PMID 11279227 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • СМИ, связанные с ферментными анализами на Викискладе?
  • Открытая мокрая посуда