Кинетика ферментов

Дигидрофолатредуктаза из E. coli с двумя ее субстратами - дигидрофолатом (справа) и НАДФН (слева), связанными в активном сайте. Белок показан в виде ленточной диаграммы , где альфа-спирали показаны красным, бета-оболочки - желтым, а петли - синим. Сгенерировано из 7DFR .

Ферментные кинетика является изучение химических реакций , которые катализируемых с помощью ферментов . ^[1] В кинетике ферментов измеряется скорость реакции и исследуются эффекты изменения условий реакции. Изучение кинетики фермента таким образом может выявить каталитический механизм этого фермента, его роль в метаболизме , то, как контролируется его активность, и как лекарство или агонист может ингибировать фермент.

Ферменты - это обычно белковые молекулы, которые манипулируют другими молекулами - субстратами ферментов . Эти целевые молекулы связываются с активным центром фермента и превращаются в продукты с помощью ряда шагов, известных как ферментативный механизм.

E + S ⇄ ES ⇄ ES * ⇄ EP ⇄ E + P

Эти механизмы можно разделить на механизмы с одним субстратом и с несколькими субстратами. Кинетические исследования ферментов, которые связывают только один субстрат, например триозофосфатизомеразу , направлены на измерение сродства, с которым фермент связывает этот субстрат, и скорости обмена. Другими примерами ферментов являются фосфофруктокиназа и гексокиназа, которые важны для клеточного дыхания (гликолиза).

Когда ферменты связывают несколько субстратов, таких как дигидрофолатредуктаза (показано справа), кинетика ферментов также может показывать последовательность, в которой эти субстраты связываются, и последовательность, в которой выделяются продукты. Примером ферментов, которые связывают один субстрат и выделяют несколько продуктов, являются протеазы , которые расщепляют один белковый субстрат на два полипептидных продукта. Другие соединяют два субстрата вместе, например ДНК-полимеразу, связывающую нуклеотид с ДНК . Хотя эти механизмы часто представляют собой сложную серию шагов, обычно существует один этап , определяющий скорость, который определяет общую кинетику. Этот шаг, определяющий скоростьможет быть химической реакцией или конформационным изменением фермента или субстратов, таких как те, которые участвуют в высвобождении продукта (ов) из фермента.

Знание структуры фермента помогает интерпретировать кинетические данные. Например, структура может предложить, как субстраты и продукты связываются во время катализа; какие изменения происходят во время реакции; и даже роль определенных аминокислотных остатков в механизме. Некоторые ферменты значительно меняют форму во время действия механизма; в таких случаях полезно определить структуру фермента со связанными аналогами субстрата и без них, которые не подвергаются ферментативной реакции.

Не все биологические катализаторы являются белковыми ферментами: катализаторы на основе РНК, такие как рибозимы и рибосомы , необходимы для многих клеточных функций, таких как сплайсинг и трансляция РНК . Основное различие между рибозимами и ферментами состоит в том, что катализаторы РНК состоят из нуклеотидов, тогда как ферменты состоят из аминокислот. Рибозимы также выполняют более ограниченный набор реакций, хотя их механизмы и кинетику реакций можно анализировать и классифицировать одними и теми же методами.

Общие принципы [ править ]

Реакция, катализируемая ферментом, использует те же самые реагенты и дает точно такие же продукты, что и некаталитическая реакция. Подобно другим катализаторам , ферменты не изменяют положения равновесия между субстратами и продуктами. ^[2] Однако, в отличие от некаталитических химических реакций, реакции, катализируемые ферментами, демонстрируют кинетику насыщения. Для данной концентрации фермента и относительно низких концентраций субстрата скорость реакции увеличивается линейно с концентрацией субстрата; молекулы фермента в значительной степени свободны для катализа реакции, и увеличение концентрации субстрата означает увеличение скорости, с которой молекулы фермента и субстрата сталкиваются друг с другом. Однако при относительно высоких концентрациях субстрата скорость реакцииасимптотически приближается к теоретическому максимуму; активные центры фермента почти все заняты субстратами, что приводит к насыщению, а скорость реакции определяется внутренней скоростью оборота фермента. ^[3] Концентрация субстрата на полпути между этими двумя предельными случаями обозначается через K _M . Таким образом, K _M - это концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. ^[3]

Двумя наиболее важными кинетическими свойствами фермента являются то, насколько легко фермент насыщается определенным субстратом, и максимальная скорость, которую он может достичь. Знание этих свойств предполагает, что фермент может делать в клетке, и может показать, как фермент будет реагировать на изменения в этих условиях.

Ферментные анализы [ править ]

Ферментные анализы - это лабораторные процедуры, которые измеряют скорость ферментативных реакций. ^[4] Поскольку ферменты не расходуются в реакциях, которые они катализируют, ферментные анализы обычно отслеживают изменения концентрации субстратов или продуктов для измерения скорости реакции. Есть много методов измерения. Спектрофотометрические анализы наблюдают изменение оптической плотности света между продуктами и реагентами; радиометрические анализы включают включение или высвобождение радиоактивностидля измерения количества произведенного продукта с течением времени. Спектрофотометрические анализы наиболее удобны, поскольку они позволяют непрерывно измерять скорость реакции. Хотя радиометрические анализы требуют удаления и подсчета образцов (т. Е. Это периодические анализы), они обычно чрезвычайно чувствительны и могут измерять очень низкие уровни активности ферментов. ^[5] Аналогичный подход заключается в использовании масс-спектрометрии для мониторинга включения или высвобождения стабильных изотопов по мере превращения субстрата в продукт. Иногда анализ терпит неудачу, и подходы необходимы, чтобы воскресить неудачный анализ. ^[4]

В наиболее чувствительных ферментных анализах используются лазеры, сфокусированные через микроскоп, чтобы наблюдать изменения в отдельных молекулах ферментов, когда они катализируют свои реакции. Эти измерения либо изменения использования в флуоресценции от кофакторов во время реакции механизма фермента, либо из флуоресцентных красителей , добавленных на конкретных участки белка к движениям отчетов , которые происходят во время катализа. ^[6] Эти исследования дают новый взгляд на кинетику и динамику отдельных ферментов, в отличие от традиционной кинетики ферментов, которая наблюдает среднее поведение популяций из миллионов молекул ферментов. ^{[7] [8]}

Пример кривой прогресса ферментного анализа показан выше. Фермент производит продукт с начальной скоростью, которая приблизительно линейна в течение короткого периода после начала реакции. По мере того, как реакция протекает и субстрат израсходован, скорость непрерывно снижается (пока субстрат не находится на уровне насыщения). Для измерения начальной (и максимальной) скорости обычно проводят ферментные анализы, пока реакция продвинулась лишь на несколько процентов в сторону полного завершения. Продолжительность периода начальной скорости зависит от условий анализа и может варьироваться от миллисекунд до часов. Однако оборудование для быстрого перемешивания жидкостей позволяет проводить быстрые кинетические измерения при начальных скоростях менее одной секунды. ^[9] Эти очень быстрые анализы необходимы для измерения кинетики перед установившимся состоянием, которые обсуждаются ниже.

Большинство исследований кинетики ферментов сосредоточено на этой начальной, приблизительно линейной части ферментативных реакций. Однако также возможно измерить полную кривую реакции и подогнать эти данные к нелинейному уравнению скорости . Этот способ измерения ферментативных реакций называется анализом кривой прогресса. ^[10] Этот подход полезен как альтернатива быстрой кинетике, когда начальная скорость слишком высока для точного измерения.

Реакции с одним субстратом [ править ]

Ферменты с моносубстратными механизмами включают изомеразы, такие как триозофосфатизомераза или бисфосфоглицератмутаза , внутримолекулярные лиазы, такие как аденилатциклаза и рибозим в форме головки молотка , РНК-лиаза. ^[11] Однако некоторые ферменты, которые имеют только один субстрат, не подпадают под эту категорию механизмов. Каталаза является примером этого, поскольку фермент реагирует с первой молекулой перекиси водорода.субстрат, окисляется и затем восстанавливается второй молекулой субстрата. Хотя задействован единственный субстрат, существование модифицированного промежуточного фермента означает, что механизм каталазы на самом деле является механизмом пинг-понга, типом механизма, который обсуждается в разделе « Реакции с несколькими субстратами » ниже.

Кинетика Михаэлиса – Ментен [ править ]

Поскольку реакции, катализируемые ферментами, являются насыщаемыми, скорость их катализа не показывает линейный ответ на увеличение содержания субстрата. Если начальная скорость реакции измеряется в диапазоне концентраций субстрата (обозначается [S]), начальная скорость реакции ( ) увеличивается по мере увеличения [S], как показано справа. Однако, когда [S] становится выше, фермент насыщается субстратом, и начальная скорость достигает V _max , максимальной скорости фермента. ^{[1] [12]}${\ displaystyle v_ {0}}$

Кинетическая модель Михаэлиса-Ментен реакции с одним субстратом показано справа. Существует начальная бимолекулярная реакция между ферментом E и субстратом S с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Скорость ферментативной реакции увеличивается с увеличением концентрации субстрата до определенного уровня, называемого V _max ; при V _max увеличение концентрации субстрата не вызывает никакого увеличения скорости реакции, поскольку больше нет фермента (E), доступного для взаимодействия с субстратом (S). Здесь скорость реакции становится зависимой от комплекса ES, и реакция становится мономолекулярной реакцией с нулевым порядком. Хотя ферментативный механизм мономолекулярной реакции ${\ displaystyle {\ ce {ES -> [k_ {cat}] E + P}}}$может быть довольно сложным, обычно существует одна ферментативная стадия, определяющая скорость, которая позволяет моделировать эту реакцию как одну каталитическую стадию с очевидной мономолекулярной константой скорости k _cat . Если путь реакции протекает через один или несколько промежуточных продуктов, k _cat будет функцией нескольких элементарных констант скорости, тогда как в простейшем случае единственной элементарной реакции (например, без промежуточных продуктов) он будет идентичен элементарной константе мономолекулярной скорости k ₂ . Кажущаяся константа мономолекулярной скорости k _cat также называется числом оборотов и обозначает максимальное количество ферментативных реакций, катализируемых за секунду.

Уравнение Михаэлиса-Ментен ^[13] описывает, как (начальная) скорость реакции v ₀ зависит от положения равновесия связывания субстрата и константы скорости k ₂ . ^{[1] [12]}

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$    (Уравнение Михаэлиса – Ментен)

с константами

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

Это уравнение Михаэлиса-Ментен является основой кинетики большинства односубстратных ферментов. В основе этого уравнения лежат два важных предположения (помимо общего предположения о механизме, включающем только ингибирование промежуточных продуктов или продуктов, а также отсутствие аллостеричности или кооперативности ). Первое предположение - это так называемое допущение квазистационарного состояния (или гипотеза псевдостационарного состояния), а именно, что концентрация связанного с субстратом фермента (и, следовательно, также несвязанного фермента) изменяется намного медленнее, чем концентрация фермента, связанного с субстратом. продукт и субстрат, и, таким образом, изменение комплекса во времени может быть установлено равным нулю . Второе предположение заключается в том, что общая концентрация фермента не меняется со временем, поэтому${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}$. Полный вывод можно найти здесь .

Константа Михаэлиса K _M экспериментально определяется как концентрация, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину V _max , что можно проверить, подставив [S] = K _M в уравнение Михаэлиса-Ментен, а также увидеть графически. Если ферментативный этап, определяющий скорость, медленный по сравнению с диссоциацией субстрата ( ), константа Михаэлиса K _M примерно равна константе диссоциации K _D комплекса ES.${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$

Если мало по сравнению с, то образуется термин, а также очень небольшой комплекс ES . Следовательно, скорость образования продукта равна${\displaystyle {\ce {[S]}}}$${\displaystyle K_{M}}$${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\approx [{\ce {S}}]/K_{M}}$${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\approx [E]}}}$

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

Таким образом, скорость образования продукта зависит от концентрации фермента, а также от концентрации субстрата, уравнение напоминает бимолекулярную реакцию с соответствующей константой скорости псевдо второго порядка . Эта константа является мерой каталитической эффективности . Наиболее эффективные ферменты достигают значения a в диапазоне 10 ⁸ - 10 ¹⁰ M ^-1 с ^-1 . Эти ферменты настолько эффективны, что эффективно катализируют реакцию каждый раз, когда сталкиваются с молекулой субстрата, и, таким образом, достигли верхнего теоретического предела эффективности ( предела диффузии ); и иногда их называют кинетически совершенными ферментами . ^[14]${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$  Но большинство ферментов далеки от совершенства: средние значения и составляют около и соответственно. ^[15]${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$${\displaystyle k_{2}}$${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$

Прямое использование уравнения Михаэлиса – Ментен для кинетического анализа динамики времени [ править ]

Наблюдаемые скорости, предсказанные уравнением Михаэлиса-Ментен, можно использовать для прямого моделирования исчезновения субстрата с течением времени и производства продукта путем включения уравнения Михаэлиса-Ментен в уравнение химической кинетики первого порядка. Однако этого можно достичь, только если осознают проблему, связанную с использованием числа Эйлера в описании химической кинетики первого порядка. т.е. e ^{- k} - это константа разделения, которая вносит систематическую ошибку в вычисления и может быть переписана как единственная константа, которая представляет оставшийся субстрат после каждого периода времени. ^[16]

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max }[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

В 1983 году Стюарт Бил (а также независимо друг от друга Сантьяго Шнелл и Клаудио Мендоса в 1997 году) разработал решение в закрытой форме для анализа кинетики динамики механизма Михаэлиса-Ментен. ^{[17] [18]} Решение, известное как уравнение Шнелла-Мендосы, имеет вид:

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

где W [] - функция Ламберта-W . ^{[19] [20]} и где F (t) -

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

Это уравнение охватывает приведенное ниже уравнение, полученное Бербераном-Сантосом ^[21], которое также справедливо, когда начальная концентрация субстрата близка к концентрации фермента,

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

где W [] - снова функция Ламберта-W .

Линейные графики уравнения Михаэлиса – Ментен [ править ]

График зависимости v от [S] выше не является линейным; хотя изначально он линейный при низком [S], он изгибается до насыщения при высоком [S]. До современной эры нелинейной аппроксимации кривых на компьютерах эта нелинейность могла затруднить точную оценку K _M и V _max . Поэтому несколько исследователей разработали линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен, такие как график Лайнуивера – Берка , диаграмма Иди – Хофсти и график Хейнса – Вульфа.. Все эти линейные представления могут быть полезны для визуализации данных, но ни одно из них не следует использовать для определения кинетических параметров, поскольку легко доступно компьютерное программное обеспечение, которое позволяет более точное определение с помощью методов нелинейной регрессии . ^{[22] [12]}

Участок Лайнуивер-Берка или двойной обратный участок является распространенным способом , иллюстрирующей кинетических данных. Это получается путем взятия обратной величины для обеих частей уравнения Михаэлиса-Ментен. Как показано справа, это линейная форма уравнения Михаэлиса – Ментен, которая дает прямую линию с уравнением y = m x + c с пересечением y, эквивалентным 1 / V _max, и пересечением по оси x графика. представляющие -1 / К _М .

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

Естественно, никакие экспериментальные значения не могут быть взяты при отрицательных 1 / [S]; нижнее предельное значение 1 / [S] = 0 ( точка пересечения y ) соответствует бесконечной концентрации субстрата, где 1 / v = 1 / V _max, как показано справа; таким образом, интервал x является экстраполяцией экспериментальных данных, полученных при положительных концентрациях. В более общем смысле , сюжет Лайнуивера-Берк перекосы важность измерений при низких концентрациях субстрата и, таким образом, может дать неточные оценки V _макс и K _M . ^[23] Более точным методом линейного построения графиков является график Иди-Хофсти . В этом случае vнанесен на график против v / [S]. В третьем распространенном линейном представлении, графике Хейнса – Вульфа , [S] / v отображается против [S]. В общем, нормализация данных может помочь уменьшить объем экспериментальной работы и может повысить надежность вывода и подходит как для графического, так и для численного анализа. ^[24]

Практическое значение кинетических констант [ править ]

Изучение кинетики ферментов важно по двум основным причинам. Во-первых, это помогает объяснить, как работают ферменты, а во-вторых, помогает предсказать, как ферменты ведут себя в живых организмах. Кинетические константы, определенные выше, K _M и V _max , имеют решающее значение для попыток понять, как ферменты работают вместе, чтобы контролировать метаболизм .

Сделать эти прогнозы нетривиально даже для простых систем. Например, оксалоацетат образуется в митохондрии под действием малатдегидрогеназы . Затем оксалоацетат может потребляться цитратсинтазой , фосфоенолпируваткарбоксикиназой или аспартатаминотрансферазой, участвуя в цикле лимонной кислоты , глюконеогенезе или аспарагиновой кислоте.биосинтез соответственно. Чтобы предсказать, сколько оксалоацетата попадает в какой путь, требуется знание концентрации оксалоацетата, а также концентрации и кинетики каждого из этих ферментов. Эта цель предсказания поведения метаболических путей достигает своего наиболее сложного выражения в синтезе огромного количества данных кинетики и экспрессии генов в математические модели целых организмов. В качестве альтернативы, одним из полезных упрощений проблемы метаболического моделирования является игнорирование лежащей в основе кинетики фермента и использование только информации о стехиометрии реакционной сети, метод, называемый анализом баланса потока . ^{[25] [26]}

Кинетика Михаэлиса – Ментен с промежуточным звеном [ править ]

Можно также рассмотреть менее простой случай

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

где существует комплекс с ферментом и промежуточным продуктом, и промежуточное соединение превращается в продукт на второй стадии. В этом случае мы имеем очень похожее уравнение ^[27]

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}}$

но константы разные

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

Мы видим, что для предельного случая , таким образом, когда последний шаг из намного быстрее, чем предыдущий шаг, мы снова получаем исходное уравнение. Математически имеем тогда и .${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$

Мультисубстратные реакции [ править ]

Реакции с несколькими субстратами следуют сложным уравнениям скорости, которые описывают, как субстраты связываются и в какой последовательности. Анализ этих реакций намного проще, если концентрация субстрата A поддерживается постоянной, а субстрат B варьируется. В этих условиях фермент ведет себя так же, как фермент с одним субстратом, и график v на [S] дает очевидные константы K _M и V _max для субстрата B. Если набор этих измерений выполняется при различных фиксированных концентрациях A, эти данные могут быть использованы для выяснения механизма реакции. Для фермента, который берет два субстрата A и B и превращает их в два продукта P и Q, существует два типа механизма: тройной комплекс и пинг-понг.

Тернарно-сложные механизмы [ править ]

В этих ферментах оба субстрата связываются с ферментом одновременно с образованием тройного комплекса EAB. Порядок связывания может быть случайным (в случайном механизме) или субстраты должны связываться в определенной последовательности (в упорядоченном механизме). Когда набор кривых v на [S] (фиксированный A, варьирующийся B) от фермента с тройным комплексным механизмом нанесен на график Лайнуивера-Берка , набор полученных линий будет пересекаться.

Ферменты с тройными комплексными механизмами включают глутатион- S- трансферазу , ^[28] дигидрофолатредуктазу ^[29] и ДНК-полимеразу . ^[30] Следующие ссылки показывают короткие анимации механизмов тройного комплекса ферментов дигидрофолатредуктазы ^[β] и ДНК-полимеразы ^[γ] .

Механизмы пинг-понга [ править ]

${\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}}$

Механизм пинг-понга для ферментативной реакции. Промежуточные продукты содержат субстраты A и B или продукты P и Q.

Как показано справа, ферменты с механизмом пинг-понга могут существовать в двух состояниях: E и химически модифицированная форма фермента E *; этот модифицированный фермент известен как промежуточный продукт . В таких механизмах субстрат A связывается, превращает фермент в E *, например, путем переноса химической группы в активный центр, а затем высвобождается. Только после высвобождения первого субстрата субстрат B может связываться и реагировать с модифицированным ферментом, регенерируя немодифицированную форму E. Когда набор кривых v на [S] (фиксированный A, варьирующийся B) от фермента с механизмом пинг-понга нанесен на график Лайнуивера-Берка, будет получен набор параллельных линий. Это называется второстепенным сюжетом .

Ферменты с механизмами пинг-понг включают в себя некоторые оксидоредуктазы , такие как тиоредоксин пероксидазы , ^[31] трансферазы , такие как acylneuraminate cytidylyltransferase ^[32] и сериновых протеаз , таких как трипсин и химотрипсин . ^[33] Сериновые протеазы представляют собой очень распространенное и разнообразное семейство ферментов, включая пищеварительные ферменты (трипсин, химотрипсин и эластаза), некоторые ферменты каскада свертывания крови и многие другие. В этих сериновых протеазах промежуточный продукт E * представляет собой ацил-фермент, образованный атакой серинового остатка активного сайта напептидная связь в белковом субстрате. Здесь приведена короткая анимация, показывающая механизм химотрипсина. ^[δ]

Обратимый катализ и уравнение Холдейна [ править ]

Внешние факторы могут ограничивать способность фермента катализировать реакцию в обоих направлениях (тогда как природа катализатора сама по себе означает, что он не может катализировать только одно направление, в соответствии с принципом микроскопической обратимости ). Мы рассматриваем случай фермента, который катализирует реакцию в обоих направлениях:

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

Установившаяся начальная скорость реакции равна ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$положительно, если реакция идет в прямом направлении ( ), и отрицательно в противном случае.${\displaystyle S\rightarrow P}$

Равновесие требует того , что происходит, когда . Это показывает, что термодинамика устанавливает связь между значениями четырех констант скорости.${\displaystyle v=0}$${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$

Значения прямых и обратных максимальные ставки, полученные для , и , соответственно, являются и , соответственно. Их соотношение не равно константе равновесия, что означает, что термодинамика не ограничивает соотношение максимальных скоростей. Это объясняет, что ферменты могут быть гораздо «лучшими катализаторами» ( с точки зрения максимальной скорости ) в одном конкретном направлении реакции. ^[34]${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$

On может также получить две константы Михаэлиса и . Уравнение Холдейна - это отношение .${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$

Следовательно, термодинамика ограничивает соотношение между прямым и обратным значениями, а не соотношение значений.${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$${\displaystyle V_{\rm {max}}}$

Кинетика не Михаэлиса – Ментен [ править ]

Многие различные ферментные системы следуют поведению, отличному от Михаэлиса-Ментен. Некоторые избранные примеры включают кинетику самокаталитических ферментов, кооперативных и аллостерических ферментов, межфазных и внутриклеточных ферментов, процессирующих ферментов и так далее. ^[12] Некоторые ферменты образуют сигмовидный v на [S] график, который часто указывает на совместное связывание субстрата с активным сайтом. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата влияет на связывание последующих молекул субстрата. Такое поведение чаще всего характерно для мультимерных ферментов с несколькими взаимодействующими активными центрами. ^{[35] [36]} Здесь механизм взаимодействия аналогичен гемоглобину., при этом связывание субстрата с одним активным центром изменяет сродство других активных центров к молекулам субстрата. Положительная кооперативность возникает, когда связывание первой молекулы субстрата увеличивает сродство других активных центров к субстрату. Отрицательная кооперативность возникает, когда связывание первого субстрата снижает сродство фермента к другим молекулам субстрата.

Аллостерические ферменты включают тирозильных млекопитающих тРНК-синтетазы, который показывает отрицательную кооперативность, ^[37] и бактериальные аспартат transcarbamoylase ^[38] и фосфофруктокиназу , ^[39] , которые показывают положительную кооперативность.

Кооперативность удивительно распространена и может помочь регулировать реакцию ферментов на изменения концентраций их субстратов. ^{[4] [12] [35]} Положительная кооперативность делает ферменты гораздо более чувствительными к [S], и их активность может сильно изменяться в узком диапазоне концентраций субстрата. Напротив, отрицательная кооперативность делает ферменты нечувствительными к небольшим изменениям [S].

Уравнение Хилла (биохимия) ^[40] часто используется для количественного описания степени кооперативности в кинетике, отличной от Михаэлиса-Ментен. Полученный коэффициент Хилла n измеряет, насколько связывание субстрата с одним активным сайтом влияет на связывание субстрата с другими активными сайтами. Коэффициент Хилла <1 указывает на отрицательную кооперативность, а коэффициент> 1 указывает на положительную кооперативность . ^[12]

Кинетика до установившегося состояния [ править ]

В первый момент после смешивания фермента с субстратом продукт не образуется и промежуточные соединения отсутствуют. Исследование следующих нескольких миллисекунд реакции называется предстационарной кинетикой. Таким образом, кинетика перед установившимся состоянием связана с образованием и потреблением промежуточных продуктов фермент-субстрат (таких как ES или E *) до тех пор, пока не будут достигнуты их установившиеся концентрации .

Этот подход был впервые применен к реакции гидролиза, катализируемой химотрипсином . ^[41] Часто обнаружение промежуточного звена является важным доказательством в исследованиях того, какой механизм следует за ферментом. Например, в механизмах пинг-понга, которые показаны выше, быстрые кинетические измерения могут отслеживать высвобождение продукта P и определять образование модифицированного промежуточного фермента E *. ^[42] В случае химотрипсина этот промежуточный продукт образуется в результате атаки на субстрат нуклеофильного серина в активном центре и образования промежуточного ацил-фермента.

На рисунке справа фермент быстро продуцирует E * в первые несколько секунд реакции. Затем скорость снижается по мере достижения устойчивого состояния. Эта фаза быстрого всплеска реакции измеряет единичный оборот фермента. Следовательно, количество продукта, высвобожденного в этом выбросе, показанное как точка пересечения на оси y графика, также дает количество функционального фермента, присутствующего в анализе. ^[43]

Химический механизм [ править ]

Важной целью измерения кинетики ферментов является определение химического механизма ферментативной реакции, т. Е. Последовательности химических этапов, которые превращают субстрат в продукт. Кинетические подходы, обсужденные выше, покажут, с какой скоростью образуются промежуточные соединения и взаимопревращаются, но они не могут точно определить, что это за промежуточные соединения.

Кинетические измерения, проведенные в различных условиях раствора или на слегка модифицированных ферментах или субстратах, часто проливают свет на этот химический механизм, поскольку они выявляют определяющую скорость стадию или промежуточные соединения в реакции. Например, разрыв ковалентной связи с атомом водорода является обычным этапом, определяющим скорость. Какой из возможных переносов водорода определяет скорость, можно показать, измерив кинетические эффекты замещения каждого водорода дейтерием , его стабильным изотопом . Скорость изменится при замене критического водорода из-за первичного кинетического изотопного эффекта , который возникает из-за того, что связи с дейтерием труднее разорвать, чем связи с водородом. ^[44]Также возможно измерить аналогичные эффекты с другими изотопными заменами, такими как ¹³ C / ¹² C и ¹⁸ O / ¹⁶ O, но эти эффекты более тонкие. ^[45]

Изотопы также можно использовать для выяснения судьбы различных частей молекул субстрата в конечных продуктах. Например, иногда трудно определить происхождение атома кислорода в конечном продукте; поскольку это могло произойти из воды или из части субстрата. Это может быть определено путем систематической замены стабильного изотопа кислорода ¹⁸ O в различные молекулы, которые участвуют в реакции, и проверки наличия изотопа в продукте. ^[46] Химический механизм также может быть выяснен путем изучения кинетики и изотопных эффектов при различных условиях pH, ^[47] путем изменения ионов металлов или других связанных кофакторов , ^[48] путемсайт-направленный мутагенез консервативных аминокислотных остатков или путем изучения поведения фермента в присутствии аналогов субстрата (ов). ^[49]

Подавление и активация ферментов [ править ]

Ингибиторы ферментов - это молекулы, которые снижают или отменяют активность ферментов, а активаторы ферментов - это молекулы, которые увеличивают каталитическую скорость ферментов. Эти взаимодействия могут быть как обратимыми (т.е. удаление ингибитора восстанавливает активность фермента), так и необратимыми (т.е. ингибитор навсегда инактивирует фермент).

Обратимые ингибиторы [ править ]

Традиционно обратимые ингибиторы ферментов классифицируются как конкурентные , неконкурентоспособные или неконкурентные , в зависимости от их влияния на K _M и V _max.. Эти различные эффекты являются результатом связывания ингибитора с ферментом E, с комплексом фермент-субстрат ES или с обоими, соответственно. Разделение этих классов возникает из-за проблемы их происхождения и приводит к необходимости использовать две разные константы привязки для одного события привязки. Связывание ингибитора и его влияние на ферментативную активность - две совершенно разные вещи, это еще одна проблема, которую традиционные уравнения не могут признать. При неконкурентном ингибировании связывание ингибитора приводит только к 100% -ному ингибированию фермента и не учитывает возможность чего-либо промежуточного. ^[50] При неконкурентном ингибировании ингибитор будет связываться с ферментом в его аллостерическом сайте; следовательно, аффинность связывания, или обратная K _Mсубстрата с ферментом останется прежним. С другой стороны, V _max будет уменьшаться по сравнению с неингибированным ферментом. На графике Лайнуивера-Берка присутствие неконкурентоспособного ингибитора иллюстрируется изменением точки пересечения по оси Y, определяемой как 1 / V _max . Х-точка пересечения, определяемая как -1 / K _M , останется прежней. При конкурентном ингибировании ингибитор будет связываться с ферментом в активном центре, конкурируя с субстратом. В результате K _M увеличится, а V _max останется прежним. ^[51]Общая форма ингибиторного термина также скрывает взаимосвязь между связыванием ингибитора с ферментом и его отношением к любому другому члену связывания, будь то уравнение Михаэлиса-Ментен или кривая доза-ответ, связанная со связыванием лигандного рецептора. Чтобы продемонстрировать взаимосвязь, можно сделать следующую перестановку:

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

Добавление нуля в нижнюю часть ([I] - [I])

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

Делим на [I] + K _i

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Это обозначение демонстрирует, что подобно уравнению Михаэлиса-Ментен, где скорость реакции зависит от процента популяции фермента, взаимодействующей с субстратом, эффект ингибитора является результатом процента популяции фермента, взаимодействующего с ингибитором. Единственная проблема с этим уравнением в его нынешней форме состоит в том, что оно предполагает абсолютное ингибирование фермента связыванием ингибитора, хотя на самом деле может иметь место широкий диапазон эффектов от 100% ингибирования перехода субстрата до всего> 0%. Чтобы учесть это, уравнение можно легко изменить, чтобы учесть различные степени ингибирования, включив член дельта V _max .

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

или же

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Этот термин затем может определять остаточную ферментативную активность, присутствующую, когда ингибитор взаимодействует с отдельными ферментами в популяции. Однако включение этого члена имеет дополнительную ценность, поскольку допускает возможность активации, если вторичный член V _max оказывается выше, чем начальный член. Чтобы также учесть возможность активации, обозначение можно затем переписать, заменив ингибитор «I» на термин-модификатор, обозначенный здесь как «X».

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Хотя эта терминология приводит к упрощенному пути решения кинетических эффектов , связанных с максимальной скоростью уравнения Михаэлиса-Ментен, он выдвигает на первый план потенциальные проблемы , связанные с термином , используемым для описания эффектов , связанных с K _M . К _М , относящиеся к сродства фермента к субстрату должны в большинстве случаев относятся к возможным изменениям в сайте связывания фермента , который будет непосредственно результата ферментативных ингибиторов взаимодействий. Таким образом, термин, аналогичный предложенному выше для модуляции V _max, должен быть уместным в большинстве ситуаций: ^[52]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Некоторые примеры обратимого торможения, относящиеся к конкурентной и неконкурентной моделям, обсуждаются в следующих статьях. ^{[53] [54] [55]}

Необратимые ингибиторы [ править ]

Ингибиторы ферментов также могут необратимо инактивировать ферменты, обычно путем ковалентной модификации остатков активного сайта. Эти реакции, которые можно назвать суицидными субстратами, имеют экспоненциальную функцию затухания и обычно являются насыщаемыми. Ниже насыщения они следуют кинетике первого порядка по отношению к ингибитору. Необратимое торможение можно разделить на два различных типа. Аффинное мечение - это тип необратимого ингибирования, при котором функциональная группа, обладающая высокой реакционной способностью, модифицирует каталитически важный остаток на интересующем белке, вызывая ингибирование. С другой стороны, механическое ингибирование включает связывание ингибитора с последующими ферментно-опосредованными изменениями, которые превращают последний в реактивную группу, которая необратимо модифицирует фермент.^[12]

Философский дискурс об обратимости и необратимости торможения [ править ]

Обсудив обратимое ингибирование и необратимое ингибирование в двух вышеупомянутых заголовках, следует отметить, что концепция обратимости (или необратимости) является чисто теоретической конструкцией, зависящей исключительно от временных рамок анализа, т. Е. Обратимого анализа. с участием ассоциации и диссоциации молекулы ингибитора в минутных временных масштабах может показаться необратимым, если анализ оценивает результат в секундах и наоборот. Существует континуум поведения ингибитора, охватывающий обратимость и необратимость в заданные непроизвольные временные рамки анализа. Существуют ингибиторы, которые проявляют медленное начало действия ^[53], и большинство из этих ингибиторов неизменно также демонстрируют прочное связывание с интересующим белком-мишенью. ^{[53] [54]}

Механизмы катализа [ править ]

Излюбленной моделью взаимодействия фермент-субстрат является индуцированная модель соответствия. ^[56] Эта модель предполагает, что начальное взаимодействие между ферментом и субстратом относительно слабое, но эти слабые взаимодействия быстро вызывают конформационные изменения в ферменте, которые усиливают связывание. Эти конформационные изменения также приближают каталитические остатки в активном центре к химическим связям в субстрате, которые будут изменены в ходе реакции. ^[57] Конформационные изменения можно измерить с помощью кругового дихроизма или интерферометрии с двойной поляризацией . После связывания один или несколько механизмов катализа понижают энергию переходного состояния реакции.за счет обеспечения альтернативного химического пути реакции. Механизмы катализа включают катализ деформацией связи; по близости и ориентации; донорами или акцепторами протонов активного центра; ковалентный катализ и квантовое туннелирование . ^{[42] [58]}

Кинетика ферментов не может доказать, какие способы катализа используются ферментом. Однако некоторые кинетические данные могут указывать на возможность исследования другими методами. Напр., Механизм пинг-понга с предустановившейся кинетикой в ​​фазе взрыва может указывать на то, что ковалентный катализ может быть важным в механизме этого фермента. В качестве альтернативы, наблюдение сильного влияния pH на V _max, но не на K _M, может указывать на то, что остаток в активном центре должен находиться в определенном состоянии ионизации для того, чтобы произошел катализ.

История [ править ]

В 1902 году Виктор Анри предложил количественную теорию кинетики ферментов ^[59], но в то время экспериментальное значение концентрации ионов водорода еще не было признано. После того, как Питер Лауриц Соренсен определил логарифмическую шкалу pH и представил концепцию буферизации в 1909 году ^[60], немецкий химик Леонор Михаэлис и доктор Мод Леонора Ментен (в то время постдокторский исследователь в лаборатории Михаэлиса) повторили эксперименты Генри и подтвердили его уравнение, которое теперь обычно называют кинетикой Михаэлиса-Ментен (иногда также кинетикой Анри-Михаэлиса-Ментен). ^[61] Их работа была продолжена GE Briggs и JBS Haldane , которые вывели кинетические уравнения, которые до сих пор широко считаются отправной точкой в ​​моделировании ферментативной активности. ^[62]

Основным вкладом подхода Анри-Михаэлиса-Ментена было рассмотрение ферментативных реакций в два этапа. В первом субстрат обратимо связывается с ферментом, образуя комплекс фермент-субстрат. Иногда это называют комплексом Михаэлиса. Затем фермент катализирует химическую стадию реакции и высвобождает продукт. Кинетика многих ферментов адекватно описывается простой моделью Михаэлиса-Ментен, но все ферменты имеют внутренние движения , которые не учитываются в модели, и могут вносить значительный вклад в общую кинетику реакции. Это можно смоделировать, введя несколько путей Михаэлиса-Ментен, которые связаны с колебаниями скорости ^{[63] [64] [65]}который является математическим расширением основного механизма Михаэлиса Ментен. ^[66]

Программное обеспечение [ править ]

ENZO (Enzyme Kinetics) - это инструмент с графическим интерфейсом для построения кинетических моделей реакций, катализируемых ферментами. ENZO автоматически генерирует соответствующие дифференциальные уравнения на основе установленной схемы ферментативной реакции. Эти дифференциальные уравнения обрабатываются числовым решателем и алгоритмом регрессии, который подбирает коэффициенты дифференциальных уравнений для экспериментально наблюдаемых кривых изменения времени. ENZO позволяет быстро оценивать конкурирующие схемы реакций и может использоваться для рутинных испытаний кинетики ферментов. ^[67]

См. Также [ править ]

• Белковая динамика
• Фермент с ограниченной диффузией
• Модель адсорбции Ленгмюра

Сноски [ править ]

α. ^ Ссылка: Интерактивное руководство по кинетике Михаэлиса – Ментен (требуется Java)

β. ^ Ссылка: механизм дигидрофолатредуктазы (Gif)

γ. ^ Ссылка: механизм ДНК-полимеразы (Gif)

δ. ^ Ссылка: Механизм химотрипсина (требуется Flash)

Ссылки [ править ]

Дальнейшее чтение [ править ]

Вводный

• Корниш-Боуден, Атель (2004). Основы кинетики ферментов (3-е изд.). Лондон: Портленд Пресс. ISBN 978-1-85578-158-0.
• Стивенс Л., Прайс NC (1999). Основы энзимологии: клеточная и молекулярная биология каталитических белков . Оксфорд [Оксфордшир]: Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-850229-6.
• Багг, Тим (2004). Введение в химию ферментов и коферментов . Кембридж, Массачусетс: издательство Blackwell Publishers. ISBN 978-1-4051-1452-3.

Передовой

• Сегел, Ирвин Х. (1993). Кинетика ферментов: поведение и анализ ферментных систем быстрого равновесия и устойчивого состояния (Новая редакция). Нью-Йорк: Вили. ISBN 978-0-471-30309-1.
• Фершт, Алан (1999). Структура и механизм в науке о белке: руководство по ферментативному катализу и сворачиванию белка . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6.
• Шнелл С., Майни П.К. (2004). «Век ферментной кинетики: надежность оценок K M и v max » . Комментарии о нотах теоретической биологии . 8 (2–3): 169–87. CiteSeerX  10.1.1.493.7178 . DOI : 10.1080 / 08948550302453 . Проверено 22 сентября 2020 .
• Уолш, Кристофер (1979). Механизмы ферментативных реакций . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-0070-8.
• Клеланд WW, Кук П. (2007). Кинетика и механизм ферментов . Нью-Йорк: Наука Гарланд. ISBN 978-0-8153-4140-6.

Внешние ссылки [ править ]

• Анимация ферментного анализа - демонстрирует эффекты изменения условий анализа.
• MACiE - База данных механизмов ферментативных реакций
• ENZYME - База данных номенклатуры ферментов Expasy
• ENZO - веб-приложение для простого построения и быстрого тестирования кинетических моделей реакций, катализируемых ферментами.
• ExCatDB - база данных каталитических механизмов ферментов
• BRENDA - Обширная база данных ферментов, содержащая субстраты, ингибиторы и диаграммы реакций
• САБИО-РК - База данных кинетики реакций
• Исследовательская группа Джозефа Краута, Калифорнийский университет в Сан-Диего - Анимация нескольких механизмов ферментативных реакций
• Символизм и терминология в кинетике ферментов - исчерпывающее объяснение концепций и терминологии в кинетике ферментов
• Введение в кинетику ферментов - доступный набор интерактивных руководств по кинетике ферментов
• Анимированный учебник по кинетике ферментов - Анимированный учебник со звуком