Флуоресцентная прижизненная визуализирующая микроскопия

---

Флуоресцентная микроскопия с изображением времени жизни или FLIM - это метод визуализации, основанный на различиях в скорости экспоненциального затухания фотонного излучения флуорофора из образца. Его можно использовать в качестве метода визуализации в конфокальной микроскопии , микроскопии двухфотонного возбуждения и многофотонной томографии.

Для создания изображения в FLIM используется время жизни флуоресценции (FLT) флуорофора, а не его интенсивность . Время жизни флуоресценции зависит от локального микроокружения флуорофора, что исключает любые ошибочные измерения интенсивности флуоресценции из-за изменения яркости источника света, интенсивности фонового света или ограниченного фотообесцвечивания. Преимущество этого метода также заключается в минимизации эффекта рассеяния фотонов в толстых слоях образца. Поскольку измерения зависят от микросреды, измерения срока службы используются в качестве индикатора pH , ^[1] вязкости ^[2] и концентрации химических веществ . ^{[3] [4]}

Флуорофор , возбуждаемый фотоном, перейдет в основное состояние с определенной вероятностью, основанной на скорости распада по ряду различных путей распада (радиационного и/или безызлучательного) . Чтобы наблюдать флуоресценцию, одним из этих путей должно быть спонтанное излучение фотона. В описании ансамбля излучаемая флуоресценция будет затухать со временем в соответствии с

В приведенном выше примере - время, - время жизни флуоресценции, - начальная флуоресценция при и - скорости для каждого пути затухания, по крайней мере один из которых должен быть скоростью затухания флуоресценции . Что еще более важно, срок службы не зависит от начальной интенсивности и излучаемого света. Это можно использовать для проведения измерений, не основанных на интенсивности, при химическом зондировании. ^[5]${\displaystyle т}$${\displaystyle \тау }$${\displaystyle I_{0}}$${\displaystyle т=0}$${\displaystyle k_{i}}$${\displaystyle k_ {f}}$${\displaystyle \тау }$

Визуализация времени жизни флуоресценции дает изображения с интенсивностью каждого пикселя, определяемой , что позволяет видеть контраст между материалами с разными скоростями затухания флуоресценции (даже если эти материалы флуоресцируют точно на одной и той же длине волны), а также создает изображения, которые показывают изменения в других пути распада, например, при визуализации FRET .${\displaystyle \тау }$

Время жизни флуоресценции можно определить во временной области с помощью импульсного источника. Когда популяция флуорофоров возбуждается ультракоротким или дельта- импульсом света, флуоресценция с временным разрешением будет экспоненциально затухать, как описано выше. Однако если импульс возбуждения или отклик обнаружения широкий, измеренная флуоресценция d(t) не будет чисто экспоненциальной. Инструментальная функция отклика IRF(t) будет свернута или смешана с функцией затухания F(t).

---