В области гистологии , патологии и клеточной биологии , фиксация является сохранение биологических тканей от распада вследствие аутолиза или гниения . Он прекращает любые текущие биохимические реакции, а также может повысить механическую прочность или стабильность обработанных тканей. Фиксация ткани является критическим этапом при подготовке гистологических срезов, ее широкая цель состоит в том, чтобы сохранить клетки и компоненты ткани и сделать это таким образом, чтобы можно было получить тонкие окрашенные срезы. Это позволяет исследовать структуру тканей, которая определяется формой и размерами таких макромолекул (внутри и вокруг клеток), какбелки и нуклеиновые кислоты .
Цели [ править ]
Выполняя свою защитную роль, фиксаторы денатурируют белки путем коагуляции, образования аддитивных соединений или комбинации процессов коагуляции и аддитивных процессов. Соединение, которое химически добавляется к макромолекулам, стабилизирует структуру наиболее эффективно, если оно способно объединяться с частями двух разных макромолекул - эффект, известный как сшивание. Фиксация ткани производится по нескольким причинам. Одна из причин - убить ткань, чтобы предотвратить посмертный распад (автолиз и гниение). [1] Фиксация сохраняет биологический материал ( ткань или клетки ) как можно ближе к его естественному состоянию в процессе подготовки ткани к исследованию. Для этого обычно необходимо выполнить несколько условий.
Во-первых, фиксатор обычно блокирует внутренние биомолекулы, особенно протеолитические ферменты, которые в противном случае переваривают или повреждают образец.
Во-вторых, фиксатор обычно защищает образец от внешних повреждений. Фиксирующие средства токсичны для большинства распространенных микроорганизмов ( в частности, бактерий ), которые могут присутствовать в образце ткани или колонизировать фиксированную ткань. Кроме того, многие фиксаторы химически изменяют фиксированный материал, делая его менее вкусным (неперевариваемым или токсичным) для условно-патогенных микроорганизмов.
Наконец, фиксаторы часто изменяют клетки или ткани на молекулярном уровне, увеличивая их механическую прочность или стабильность. Эта повышенная прочность и жесткость могут помочь сохранить морфологию (форму и структуру) образца при его обработке для дальнейшего анализа.
Даже самая тщательная фиксация приводит к изменению образца и появлению артефактов, которые могут помешать интерпретации клеточной ультраструктуры. Ярким примером является бактериальная мезосома , которая в 1970-е годы считалась органеллой у грамположительных бактерий , но позже была показана с помощью новых методов, разработанных для электронной микроскопии, как просто артефакт химической фиксации. [2] [3] Стандартизация фиксации и других процедур обработки тканей учитывает это введение артефактов, устанавливая, какие процедуры вводят какие виды артефактов. Исследователи, которые знают, какие типы артефактов следует ожидать от каждого типа ткани и техники обработки, могут точно интерпретировать участки с артефактами или выбрать методы, которые минимизируют артефакты в интересующих областях.
Процесс [ править ]
Фиксация обычно является первым этапом многоступенчатого процесса подготовки образца биологического материала для микроскопии или другого анализа. Таким образом, выбор фиксатора и протокола фиксации может зависеть от дополнительных этапов обработки и запланированных окончательных анализов. Например, в иммуногистохимии используются антитела, которые связываются с конкретным белком-мишенью. Длительная фиксация может химически маскировать эти мишени и предотвращать связывание антител. В этих случаях обычно используется метод «быстрого исправления» с использованием холодного формалина в течение примерно 24 часов. Метанол (100%) также можно использовать для быстрой фиксации, и это время может варьироваться в зависимости от биологического материала. Например, MDA-MB 231Клетки рака груди человека можно зафиксировать всего 3 минуты холодным метанолом (-20 ° C). Для исследований локализации ферментов ткани следует либо предварительно слегка зафиксировать, либо после фиксации после образования продукта активности фермента.
![[икона]](/wiki/File:Wiki_letter_w_cropped.svg){kind=small} | Этот раздел нуждается в расширении . Вы можете помочь, добавив к нему . ( Июнь 2008 г. ) |
Типы [ править ]
Обычно существует три типа процессов фиксации в зависимости от исходного образца:
Тепловая фиксация: после высыхания мазка при комнатной температуре предметное стекло захватывают щипцами или прищепкой и несколько раз пропускают через пламя горелки Бунзена, чтобы убить жар и прикрепить организм к предметному стеклу. Обычно используется с бактериями и археями. Тепловая фиксация обычно сохраняет общую морфологию, но не внутренние структуры. Тепло денатурирует протеолитический фермент и предотвращает автолиз. Тепловая фиксация не может использоваться в методе капсульного окрашивания, так как тепловая фиксация приведет к сжатию или разрушению капсулы ( гликокаликс ) и не будет видна в пятнах.
Погружение: образец ткани погружают в фиксирующий раствор, объем которого минимум в 20 раз превышает объем фиксируемой ткани. Для фиксации фиксатор должен диффундировать через ткань, поэтому необходимо учитывать размер и плотность ткани, а также тип фиксатора. Это распространенный метод для сотовых приложений. Использование большего образца означает, что фиксатору требуется больше времени, чтобы достичь более глубоких тканей.
Перфузия: фиксация посредством кровотока. Фиксатор вводится в сердце с объемом инъекции, соответствующим сердечному выбросу. Фиксатор распространяется по всему телу, и ткань не отмирает, пока не зафиксируется. Это имеет преимущество в сохранении идеальной морфологии, но недостатком является то, что объект умирает, а стоимость фиксатора, необходимого для более крупных организмов, высока.
Химическая фиксация [ править ]
В процессах как иммерсионной, так и перфузионной фиксации используются химические фиксаторы для сохранения структур в состоянии (как химическом, так и структурном), максимально приближенном к живой ткани. Для этого требуется химический фиксатор.
 | В этом разделе не процитировать любые источники . ( Январь 2018 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения ) |
Сшивающие фиксаторы - альдегиды [ править ]
Сшивающие фиксаторы действуют, создавая ковалентные химические связи между белками в ткани. Это прикрепляет растворимые белки к цитоскелету и придает ткани дополнительную жесткость. Сохранение временной или тонкой структуры цитоскелета, такой как сокращения во время волн эмбриональной дифференцировки, лучше всего достигается предварительной обработкой с использованием микроволн перед добавлением перекрестно связывающего фиксатора. [4] [5]
Наиболее часто используемым фиксатором в гистологии является формальдегид . Обычно его используют в виде 10% нейтрального забуференного формалина (NBF), то есть прибл. 3,7–4,0% формальдегида в фосфатном буфере, pH 7. Поскольку формальдегид является газом при комнатной температуре, формалин - газообразный формальдегид, растворенный в воде (~ 37% мас. / Об.), - используется при приготовлении первого фиксатора. Формальдегид фиксирует ткань, сшивая белки, в первую очередь остатки основной аминокислоты лизина.. Его эффекты обратимы при избытке воды, и он позволяет избежать пигментации формалином. Параформальдегид также широко используется и при нагревании деполимеризуется обратно в формалин, что также делает его эффективным фиксатором. Другие преимущества параформальдегида включают длительное хранение и хорошее проникновение в ткани. Это особенно хорошо для методов иммуногистохимии. Пары формальдегида также можно использовать в качестве фиксатора для мазков клеток.
Еще один популярный альдегид для фиксации - глутаральдегид.. Он действует аналогично формальдегиду, вызывая деформацию α-спиралей белков. Однако глутаральдегид является более крупной молекулой, чем формальдегид, и поэтому проникает через мембраны медленнее. Следовательно, фиксация глутаральдегида на более толстых образцах тканей может быть затруднена; это можно устранить, уменьшив размер образца ткани. Одним из преимуществ фиксации глутаральдегида является то, что он может давать более жесткий или прочно связанный фиксированный продукт - его большая длина и две альдегидные группы позволяют ему «соединять» и связывать более удаленные пары белковых молекул. Он вызывает быстрые и необратимые изменения, хорошо подходит для электронной микроскопии, хорошо работает при 4 ° C и дает наилучшие общие цитоплазматические и ядерные детали. Однако он не идеален для иммуногистохимического окрашивания.
Некоторые протоколы фиксации требуют комбинации формальдегида и глутарового альдегида, чтобы их силы дополняли друг друга.
Эти сшивающие фиксаторы, особенно формальдегид, как правило, сохраняют вторичную структуру из белков , а также могут сохранить наиболее третичную структуру .
Осаждающие фиксаторы - спирты [ править ]
Осаждающие (или денатурирующие ) фиксаторы действуют, снижая растворимость белковых молекул и часто нарушая гидрофобные взаимодействия, которые придают многим белкам их третичную структуру. Осадки и агрегация белков является очень отличается от процесса сшивания , что происходит с альдегидными фиксаторами.
Наиболее распространенными фиксаторами-осадителями являются этанол и метанол . Их обычно используют для исправления замороженных срезов и мазков. Также используется ацетон , и было показано, что он обеспечивает лучшую гистологическую сохранность, чем замороженные срезы при использовании в методике ацетон-метилбензоат-ксилола (AMEX).
Метанол, этанол и ацетон, денатурирующие белок, редко используются по отдельности для фиксации блоков, если не исследуются нуклеиновые кислоты.
Уксусная кислота представляет собой денатурирующий агент, который иногда используется в сочетании с другими фиксирующими осаждающими средствами, такими как AFA Дэвидсона. [6] Известно, что спирты сами по себе вызывают значительное сжатие и затвердевание ткани во время фиксации, в то время как одна уксусная кислота вызывает набухание ткани; их сочетание может привести к лучшему сохранению морфологии тканей .
Окислители [ править ]
Окислительные фиксаторы могут реагировать с боковыми цепями белков и других биомолекул, обеспечивая образование поперечных связей, стабилизирующих структуру ткани. Однако они вызывают обширную денатурацию, несмотря на сохранение тонкой клеточной структуры, и используются в основном в качестве вторичных фиксаторов.
Четырехокись осмия часто используется в качестве вторичного фиксатора при подготовке образцов для электронной микроскопии . (Он не используется для световой микроскопии, так как очень плохо проникает в толстые участки ткани.)
Дихромат калия , хромовая кислота и перманганат калия находят применение в определенных гистологических препаратах.
Mercurials [ править ]
Ртути, такие как B-5 и фиксатор Ценкера, обладают неизвестным механизмом, который увеличивает яркость окрашивания и дает отличную детализацию ядер. Несмотря на свою скорость, ртуть плохо проникает в ткань и вызывает усадку. Лучшее их применение - фиксация кроветворных и ретикулоэндотелиальных тканей. Также обратите внимание, что, поскольку они содержат ртуть, при утилизации необходимо соблюдать осторожность.
Пикраты [ править ]
Пикраты хорошо проникают в ткани, вступая в реакцию с гистонами и основными белками, образуя кристаллические пикраты с аминокислотами и осаждая все белки. Он является хорошим фиксатором для соединительной ткани, хорошо сохраняет гликоген и извлекает липиды, что дает лучшие результаты по сравнению с формальдегидом при иммуноокрашивании биогенных и полипептидных гормонов. Однако он вызывает потерю базофилов, если образец не будет тщательно промыт после фиксации.
Фиксатор НАДЕЖДА [ править ]
Эффект защиты органических растворителей, опосредованный буфером гепес-глутаминовой кислоты (HOPE), придает формалино-подобную морфологию, отличное сохранение белковых антигенов для иммуногистохимии и гистохимии ферментов, хорошие выходы РНК и ДНК и отсутствие сшивающих белков.
Ссылки [ править ]
- ^ Карсон, Фрейда L; Криста Хладик (2009). Гистотехнология: текст для самообучения (3-е изд.). Гонконг: Американское общество клинической патологии Press. п. 2. ISBN 978-0-89189-581-7.
- ^ Ryter А (1988). «Вклад новых криометодов в лучшее знание анатомии бактерий». Аня. Inst. Pasteur Microbiol . 139 (1): 33–44. DOI : 10.1016 / 0769-2609 (88) 90095-6 . PMID 3289587 .
- ^ Фридрих, CL; D Moyles; Т. Дж. Беверидж; REW Hancock (2000). «Антибактериальное действие структурно разнообразных катионных пептидов на грамположительные бактерии» . Противомикробные препараты и химиотерапия . 44 (8): 2086–2092. DOI : 10.1128 / AAC.44.8.2086-2092.2000 . PMC 90018 . PMID 10898680 .
- ^ Быстрая микроволновая фиксация клеточных монослоев сохраняет связанные с микротрубочками клеточные структуры J Histochem Cytochem. 2008 июл; 56 (7): 697–709. DOI: 10.1369 / jhc.7A7370.2008
- ^ Гордон, Н. Гордон, Р. Объяснение эмбриогенеза World Scientific Publishing , Сингапур, 2016 стр. 527
- ^ «Состав AFA Дэвидсона в Университете Аризоны, веб-сайт Департамента ветеринарных наук и микробиологии (доступ 22 февраля 2013 г.)» . Архивировано из оригинала на 2011-08-24 . Проверено 23 февраля 2013 .
Внешние ссылки [ править ]
| Ресурсы библиотеки по фиксации (гистологии) |
|
- Крепление образцов для изготовления постоянных слайдов
- Стратегии фиксации и составы для иммуногистохимического окрашивания
