Флуоресценция в науках о жизни

Распределение флуоресцентных белков у животных.

Гиппокамп из мыши изображается с помощью флуоресцентной микроскопии .

Спектры биофлуоресцентного излучения земноводных

Примеры использования флуоресцентных белков для визуализации в биологических науках

Флуоресценция обычно используется в биологических науках как неразрушающий способ отслеживания или анализа биологических молекул с помощью флуоресценции. Некоторые белки или небольшие молекулы в клетках обладают естественной флуоресценцией, что называется собственной флуоресценцией или аутофлуоресценцией (например, НАДН , триптофан или эндогенный хлорофилл , фикоэритрин или зеленый флуоресцентный белок ). Альтернативно, специфические или общие белки, нуклеиновые кислоты , липиды или небольшие молекулы могут быть «помечены» внешним флуорофором , флуоресцентным красителем.который может быть небольшой молекулой, белком или квантовой точкой . Существует несколько методов использования дополнительных свойств флуорофоров , таких как резонансный перенос энергии флуоресценции , когда энергия передается безызлучательно конкретному соседнему красителю, что позволяет обнаруживать близость или активацию белка; другой - изменение свойств, таких как интенсивность, определенных красителей в зависимости от среды, в которой они находятся, что позволяет использовать их в структурных исследованиях. ^{[1] [2] [3]}

Флуоресценция [ править ]

Принцип флуоресценции заключается в том, что флуоресцентная составляющая содержит электроны, которые могут поглощать фотон и на короткое время переходить в возбужденное состояние, прежде чем либо рассеять энергию без излучения, либо испустить ее как фотон , но с меньшей энергией, т. Е. С большей длиной волны ( длина волны и энергия обратно пропорциональны). ^[4] Разница в длинах волн возбуждения и излучения называется стоксовым сдвигом , а время, которое требуется возбужденному электрону для излучения фотона, называется временем жизни . Квантовый выходявляется показателем эффективности красителя (это отношение испускаемых фотонов к поглощенному фотону), а коэффициент экстинкции - это количество света, которое может быть поглощено флуорофором. И квантовый выход, и коэффициент экстинкции специфичны для каждого флуорофора, и умножение их вместе позволяет рассчитать яркость флуоресцентной молекулы. ^[5]

Маркировка [ править ]

Реактивные красители [ править ]

Флуорофоры могут быть присоединены к белкам через определенные функциональные группы, такие как:

• аминогруппы ( например, через сукцинимид или изотиоцианат );
• карбоксильные группы ( например, посредством активации карбодиимидом и последующего связывания с амином );
• тиол ( например, через малеимид или йодацетамиды);
• азид ( например, с помощью щелочной химии с концевым алкином );

или неспецифично ( глутаральдегид ) или нековалентно ( например, через гидрофобность и т.д.).

Эти флуорофоры представляют собой небольшие молекулы, белки или квантовые точки.

Органические флуорофоры флуоресцируют благодаря делокализованным электронам, которые могут перескакивать через полосу и стабилизировать поглощенную энергию, поэтому большинство флуорофоров являются сопряженными системами . Несколько семей выходят, и их возбуждение варьируется от инфракрасного до ультрафиолетового .
Лантаноиды (хелатный) однозначно флуоресцентные металлы, которые излучают благодаря переходам с 4 F орбиты, которые запрещены, следовательно , они имеют очень низкие коэффициенты поглощения и медленные выбросы, требуя возбуждения через флуоресцентные органические комплексоны ( например , dipicolinate основанный тербий (III) энтеросорбенты ^[6] ).
Третий класс небольшой молекулы флуорофоры является то , что из переходного металла -лиганда комплексов , которые отображают молекулярные флуоресценции от заряда состояния передачи металла-лиганда , который частично запрещен, они , как правило , комплексы рутения , рений или осмия .

Квантовые точки [ править ]

Квантовые точки - это флуоресцентные полупроводниковые наночастицы .

Флуоресцентные белки [ править ]

Несколько флуоресцентный белок существует в природе ^{[ править ]} , но наиболее важным из них в качестве инструмента исследования является зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea виктория , ^[7] , которые самопроизвольно флуоресцирует при сгибе с помощью специфических остатков серина-тирозин-глицин. Преимущество GFP и других флуоресцентных белков по сравнению с органическими красителями или квантовыми точками состоит в том, что они могут экзогенно экспрессироваться в одних клетках или в виде слитого белка , белка, который создается путем лигирования флуоресцентного гена (например, GFP) с другим геном и экспрессия которого обеспечивается промотором гена домашнего хозяйстваили другой конкретный промотор. Этот подход позволяет использовать флуоресцентные белки в качестве репортеров для любого количества биологических событий, таких как субклеточная локализация и паттерны экспрессии . Вариант GFP естественным образом встречается у кораллов , в частности у Anthozoa , и было создано несколько мутантов, которые охватывают видимый спектр и флуоресцируют дольше и стабильнее. Другие белки являются флуоресцентными, но требуют кофактора флуорофора и, следовательно, могут использоваться только in vitro ; они часто встречаются в растениях и водорослях (фитофлюоры, фикобилипротеины, такие как аллофикоцианин ).

Биолюминесценция и флуоресценция [ править ]

Флуоресценция , хемилюминесценция и фосфоресценция - это 3 различных типа люминесцентных свойств, то есть испускание света веществом. Флуоресценция - это свойство, при котором свет поглощается и излучается в течение нескольких наносекунд (примерно 10 нс) при более низкой энергии (= более высокая длина волны), в то время как биолюминесценция - это биологическая хемилюминесценция , свойство, при котором свет генерируется химической реакцией фермента на субстрат. Фосфоресценция является свойство материалов поглощать свет и испускать энергетические несколько миллисекунд или более позднее (из - за запрещенные переходы в основном состояние в виде триплетного состояния, а флуоресценция происходит в возбужденных синглетных состояниях ). До недавнего времени не применялся в исследованиях в области биологических наук из-за размера неорганических частиц. Однако граница между флуоресценцией и фосфоресценцией не четко очерчена, поскольку комплексы переходный металл- лиганд, которые объединяют металл и несколько органических фрагментов, имеют длительные времена жизни, вплоть до нескольких микросекунд (поскольку они демонстрируют смешанные синглетно-триплетные состояния).

Сравнение с радиоактивностью [ править ]

До его широкого использования в последние три десятилетия наиболее распространенной меткой была радиоактивность .

Преимущества флуоресценции перед радиоактивными метками заключаются в следующем:

• Флуоресценция более безопасна в использовании и не требует радиологического контроля.
• Одновременно можно использовать несколько флуоресцентных молекул, при условии, что они не перекрываются, ср. FRET, в то время как с радиоактивностью могут использоваться два изотопа ( тритий и изотоп с низкой энергией, такой как 33 P из-за разной интенсивности), но для этого требуется специальное оборудование (тритиевый экран и обычный люминофорный экран для визуализации или специальный двухканальный детектор ^[8]. ).

Примечание: канал похож на «цвет», но отличается, это пара фильтров возбуждения и излучения, специфичных для красителя, например, микроматрицы Agilent являются двухканальными, работают с cy3 и cy5, они в просторечии называются зеленым и красным.

Флуоресценция не обязательно более удобна в использовании, поскольку для нее требуется собственное специализированное детекторное оборудование. Для неколичественных или относительных количественных измерений это может быть полезно, но оно плохо подходит для проведения абсолютных измерений из-за тушения флуоресценции , тогда как измерение молекул с радиоактивной меткой всегда является прямым и высокочувствительным.

К недостаткам флуорофоров можно отнести:

• Существенно изменяет свойства молекулы с флуоресцентной меткой.
• Вмешательство в нормальные биологические процессы
• Токсичность

Дополнительные полезные свойства [ править ]

Основное свойство флуоресценции широко используется, например, маркер меченых компонентов в клетках ( флуоресцентная микроскопия ) или индикатор в растворе ( флуоресцентная спектроскопия ), но другие дополнительные свойства, не обнаруживаемые при радиоактивности, делают его еще более широко используемым.

FRET [ править ]

FRET (резонансная передача энергии Фёрстера) - это свойство, при котором энергия возбужденного электрона одного флуорфора, называемого донором, передается ближайшему акцепторному красителю, либо темному тушителю, либо другому флуорофору, спектр возбуждения которого перекрывается со спектром излучения донорного красителя, что приводит к снижению флуоресценции. Это можно использовать для:

• обнаруживать, вступают ли в контакт два меченых белка или нуклеиновых кислоты или гидролизуются ли одиночные молекулы с двойной меткой;
• обнаруживать изменения экстерьера;
• измерить концентрацию с помощью анализа конкурентного связывания.

Чувствительность к окружающей среде [ править ]

Чувствительные к окружающей среде красители меняют свои свойства (интенсивность, период полураспада, спектры возбуждения и излучения) в зависимости от полярности (гидрофобности и заряда) окружающей среды. Примеры включают: индол , каскад желтый, продан, дансил, дапоксил, NBD, PyMPO, пирен и диэтиламинокумарин.
Это изменение наиболее заметно, когда электронодонорные и электроноакцепторные группы размещаются на противоположных концах ароматической кольцевой системы ^[9], поскольку это приводит к большому изменению дипольного момента при возбуждении.

Когда флуорофор возбужден, он обычно имеет больший дипольный момент (μ _E ), чем в основном состоянии (μ _G ). Поглощение фотона флуорофором занимает несколько пикосекунд. Перед высвобождением этой энергии (излучение: 1–10 нс) молекулы растворителя, окружающие флуорофор, переориентируются (10–100 пс) из-за изменения полярности в возбужденном синглетном состоянии; этот процесс называется релаксацией растворителя. В результате этой релаксации энергия возбужденного состояния флуорофора понижается (более длинная длина волны), следовательно, флуорофоры, которые имеют большое изменение дипольного момента, имеют большие изменения стоксового сдвига в различных растворителях. Разницу между уровнями энергии можно приблизительно определить с помощью уравнения Липпера-Матага.

Гидрофобным краситель представляет собой краситель , который нерастворим в воде, свойство , не зависящий от сольватохромии.
Кроме того, термин « чувствительный к окружающей среде» в химии на самом деле описывает изменения, вызванные одним из множества различных факторов окружающей среды, таких как pH или температура, а не только полярностью; однако в биохимии чувствительный к окружающей среде флуорфор и сольватохромный флуорофор используются взаимозаменяемо: это соглашение настолько широко распространено, что поставщики описывают их как чувствительные к окружающей среде, а не сольватохромные.

Время жизни флуоресценции [ править ]

Флуоресцентные фрагменты испускают фотоны через несколько наносекунд после поглощения, следуя экспоненциальной кривой затухания, которая различается для разных красителей и зависит от окружающего растворителя. Когда краситель присоединяется к макромолекулам, кривая распада становится многоэкспоненциальной. Конъюгированные красители обычно имеют время жизни от 1 до 10 нс, существует небольшое количество более долгоживущих исключений, в частности, пирен со временем жизни 400 нс в дегазированных растворителях или 100 нс в липидах и коронен с 200 нс. К другой категории флуорфоров относятся флуоресцентные металлоорганические соединения (лантаноиды и комплексы переходный металл-лиганд), которые были описаны ранее., которые имеют гораздо более длительные времена жизни из-за ограниченных состояний: лантаноиды имеют время жизни от 0,5 до 3 мс, в то время как комплексы переходный металл-лиганд имеют время жизни от 10 нс до 10 мкс. Обратите внимание, что срок службы флуоресценции не следует путать со сроком службы фотодеструкции или сроком годности красителя.

Мультифотонное возбуждение [ править ]

Многофотонное возбуждение - это способ фокусировки плоскости обзора микроскопа с использованием преимущества явления, когда два фотона с низкой энергией одновременно поглощаются флуоресцентной составляющей, которая обычно поглощает один фотон с удвоенной индивидуальной энергией: скажем, два фотона в ближнем ИК-диапазоне (800 нм) для возбуждения УФ-красителя (400 нм).

Анизотропия флуоресценции [ править ]

Совершенно неподвижная флуоресцентная составляющая при возбуждении поляризованным светом будет излучать свет, который также поляризован. Однако, если молекула движется, она будет «искажать» поляризацию света, излучая падающий свет в другом направлении.

Методы [ править ]

• Флуоресцентная микроскопия тканей, клеток или субклеточных структур выполняется путем мечения антитела флуорофором и предоставления антителу возможности найти свой антиген-мишень в образце. Маркировка нескольких антител разными флуорофорами позволяет визуализировать несколько мишеней на одном изображении.
• Автоматическое секвенирование ДНК методом обрыва цепи ; каждое из четырех различных оснований, завершающих цепь, имеет свой собственный специфический флуоресцентный тег. Когда меченые молекулы ДНК разделены, флуоресцентная метка возбуждается УФ-источником, и идентичность основания, завершающего молекулу, определяется длиной волны испускаемого света.

• Обнаружение ДНК: соединение бромистого этидия , когда оно свободно изменяет свою конформацию в растворе, имеет очень слабую флуоресценцию. Флуоресценция бромистого этидия значительно усиливается, когда он связывается с ДНК, поэтому это соединение очень полезно для визуализации местоположения фрагментов ДНК при электрофорезе в агарозном геле . Бромистый этидий может быть токсичным - якобы более безопасной альтернативой является краситель SYBR Green .
• ДНК микрочипов .
• Иммунология: к антителу присоединена флуоресцентная химическая группа, и участки (например, на микроскопическом образце), где связывалось антитело, можно увидеть и даже количественно оценить по флуоресценции.
• FACS ( сортировка флуоресцентно-активируемых клеток ).
• Микромасштабный термофорез (MST) использует флуоресценцию в качестве считывающего устройства для количественной оценки направленного движения биомолекул в микроскопических температурных градиентах.
• Флуоресценция использовалась для изучения структуры и конформации ДНК и белков с помощью таких методов, как резонансный перенос энергии флуоресценции , который измеряет расстояние на уровне ангстрем. Это особенно важно в комплексах из множества биомолекул.
• Флуоресценцию можно применять для изучения совместной локализации различных интересующих белков. ^[10] Затем его можно проанализировать с помощью специального программного обеспечения, такого как CoLocalizer Pro .

Кроме того, многие биологические молекулы обладают собственной флуоресценцией, которую иногда можно использовать без необходимости прикрепления химической метки. Иногда эта собственная флуоресценция изменяется, когда молекула находится в определенном окружении, поэтому можно измерить распределение или связывание молекулы. Например, билирубин обладает высокой флуоресценцией, когда он связывается с определенным участком сывороточного альбумина. Протопорфирин цинка , образующийся в развивающихся эритроцитах вместо гемоглобина, когда железо недоступно или присутствует свинец, имеет яркую флуоресценцию и может использоваться для обнаружения этих проблем.

Количество применений флуоресценции в биомедицинских, биологических и смежных науках постоянно расширяется. Методы анализа в этих областях также развиваются, часто с номенклатурой в виде таких сокращений, как: FLIM , FLI, FLIP , CALI, FLIE, FRET , FRAP , FCS , PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP или TIRF.. Большинство этих методов основано на флуоресцентных микроскопах, в которых используются источники света высокой интенсивности, обычно ртутные или ксеноновые лампы, светодиоды или лазеры, для возбуждения флуоресценции в исследуемых образцах. Затем оптические фильтры отделяют возбуждающий свет от испускаемой флуоресценции, которую необходимо обнаружить глазом, камерой (ПЗС) или другим детектором света (например, фотоумножителями, спектрографами). В настоящее время проводятся значительные исследования, направленные на улучшение возможностей таких микроскопов, используемых флуоресцентных зондов и областей применения, в которых они применяются. Особо следует отметить конфокальные микроскопы, в которых для получения оптических срезов используется точечное отверстие , которое позволяет получить количественное трехмерное изображение образца.

См. Также [ править ]

• Флуорофор
• Флуоресцентная микроскопия
• Флуоресцентная визуализация
• Флуоресцентные биосенсоры глюкозы
• Рентгеноскопия

Ссылки [ править ]