Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Принцип FRAP A) Двухслойный слой равномерно помечен флуоресцентной меткой B) Эта метка выборочно фотообесцвечивается небольшим (~ 30 микрометров) быстрым световым импульсом C) Интенсивность внутри этой обесцвеченной области отслеживается по мере того, как обесцвеченный краситель диффундирует и появляется новый краситель диффундирует в D) Постепенно восстанавливается равномерная интенсивность

Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) - это метод определения кинетики диффузии через ткань или клетки. Он способен количественно определять двумерную боковую диффузию молекулярно тонкой пленки, содержащей флуоресцентно меченые зонды, или исследовать отдельные клетки. Этот метод очень полезен в биологических исследованиях диффузии клеточной мембраны и связывания с белками. Кроме того, поверхностное осаждение флуоресцирующего фосфолипидного бислоя (или монослоя) позволяет характеризовать гидрофильные (или гидрофобные ) поверхности с точки зрения структуры поверхности и свободной энергии.

Подобные, хотя и менее известные методы были разработаны для исследования трехмерной диффузии и связывания молекул внутри клетки; их также называют FRAP.

Экспериментальная установка [ править ]

Основное устройство состоит из оптического микроскопа , источника света и люминесцентного зонда. Флуоресцентное излучение зависит от поглощения определенной длины оптической волны или цвета, что ограничивает выбор ламп. Чаще всего в сочетании с цветным фильтром используется ртутный или ксеноновый источник широкого спектра действия . Техника начинается с сохранения фонового изображения образца перед фотообесцвечиванием. Затем источник света фокусируется на небольшом участке видимой области либо путем переключения на объектив микроскопа с большим увеличением, либо с помощью лазера.свет соответствующей длины волны. Флуорофоры в этой области получают освещение высокой интенсивности, что приводит к быстрому истечению их времени жизни флуоресценции (ограниченное примерно 10 5 фотонами до исчезновения). Теперь изображение в микроскоп представляет собой однородное флуоресцентное поле с заметным темным пятном. По мере продолжения броуновского движения все еще флуоресцирующие зонды будут распространяться по всему образцу и заменять нефлуоресцентные зонды в обесцвеченной области. Эта диффузия происходит упорядоченным образом, аналитически определяемым из уравнения диффузии . Предполагая гауссов профиль отбеливающего луча, постоянную диффузии D можно просто вычислить по формуле:

где w - радиус пучка, а t D - «характерное» время диффузии. [1] [2]

Приложения [ править ]

Поддерживаемые липидные бислои [ править ]

Первоначально метод FRAP был предназначен для использования в качестве средства характеристики подвижности отдельных липидных молекул внутри клеточной мембраны. [1] Несмотря на большую полезность в этой роли, текущие исследования больше склоняются к изучению искусственных липидных мембран. Эти биомиметические структуры, поддерживаемые гидрофильными или гидрофобными субстратами (для получения липидных бислоев или монослоев соответственно) и включающие мембранные белки , потенциально полезны в качестве аналитических устройств для определения идентичности неизвестных веществ, понимания клеточной трансдукции и определения участков связывания лиганда.

Связывание с белками [ править ]

Этот метод обычно используется в сочетании с белками слияния зеленого флуоресцентного белка (GFP) , где исследуемый белок сливается с GFP. При возбуждении светом определенной длины волны белок флуоресцирует. [3] Когда исследуемый белок продуцируется GFP, флуоресценцию можно отслеживать. Фотодеструкция GFP с последующим наблюдением за репопуляцией в обесцвеченной области может раскрыть информацию о партнерах по взаимодействию белков, целостности органелл и перемещении белков. [4]

Если по прошествии некоторого времени флуоресценция больше не достигает исходного уровня, значит, некоторая часть флуоресценции вызвана неподвижной фракцией (которая не может быть восполнена за счет диффузии). Точно так же, если флуоресцентные белки связываются со статическими клеточными рецепторами, скорость восстановления будет замедляться фактором, связанным с коэффициентами ассоциации и диссоциации связывания. Это наблюдение совсем недавно было использовано для исследования связывания с белками. [3] [5] [6] Точно так же, если белок, меченный GFP, конститутивно включен в более крупный комплекс, динамика восстановления флуоресценции будет характеризоваться диффузией более крупного комплекса. [7]

Приложения за пределами мембраны [ править ]

FRAP также можно использовать для мониторинга белков за пределами мембраны. После того, как интересующий белок становится флуоресцентным, как правило, путем экспрессии в виде слитого белка GFP, используется конфокальный микроскоп для фотообесцвечивания и мониторинга области цитоплазмы , [3] митотического веретена , ядра или другой клеточной структуры. [8] Затем можно построить график зависимости средней флуоресценции в области от времени, прошедшего с момента фотообесцвечивания, и полученная кривая может дать кинетические коэффициенты, например, для реакций связывания белка и / или коэффициента диффузии белка в среде, в которой он находится. контролируется. [9]Часто единственной рассматриваемой динамикой являются диффузия и взаимодействия связывания / расцепления, однако в принципе белки также могут перемещаться посредством потока, т.е. подвергаться направленному движению, и это было очень рано признано Axelrod et al. [1] Это может быть связано с потоком цитоплазмы или нуклеоплазмы или переносом по филаментам в клетке, например, по микротрубочкам, с помощью молекулярных моторов .

Анализ наиболее прост, когда восстановление флуоресценции ограничено либо скоростью диффузии в обесцвеченную область, либо скоростью, с которой обесцвеченные белки отсоединяются от своих участков связывания в обесцвеченной области и заменяются флуоресцентным белком. Давайте посмотрим на эти два предела для обычного случая обесцвечивания слитого белка GFP в живой клетке.

Ограниченное диффузией восстановление флуоресценции [ править ]

Для круглого пятна обесцвечивания радиуса и восстановления с преобладанием диффузии флуоресценция описывается уравнением, полученным Soumpasis [10] (которое включает модифицированные функции Бесселя и )

с характерным масштабом времени для диффузии, а - время. - нормализованная флуоресценция (стремится к 1 до бесконечности). Масштаб времени диффузии для обесцвеченного пятна радиуса равен , где D - коэффициент диффузии.

Обратите внимание, что это для мгновенного отбеливания со ступенчатым профилем функции, т. Е. Предполагается , что доля белка, которая должна быть мгновенно обесцвечена в определенный момент времени, составляет , и , для - расстояние от центра обесцвеченной области. Также предполагается, что восстановление может быть смоделировано диффузией в двух измерениях, которые также являются как однородными, так и изотропными. Другими словами, эта диффузия происходит в однородной среде, поэтому эффективная константа диффузии D одинакова везде, и что диффузия изотропна, то есть происходит с одинаковой скоростью по всем осям в плоскости.

На практике в ячейке ни одно из этих предположений не будет строго верным.

  1. Отбеливание не будет мгновенным. В частности, если требуется сильное отбеливание большой площади, на отбеливание может уйти значительная часть шкалы времени диффузии . Тогда значительная часть обесцвеченного белка будет диффундировать из обесцвеченной области фактически во время отбеливания. В противном случае , чтобы учесть это будет ввести существенную ошибку в D . [11] [12] [13]
  2. Выбеленный профиль не будет радиальным ступенчатым. Если обесцвеченное пятно фактически представляет собой один пиксель, то обесцвечивание как функция положения обычно будет ограничиваться дифракцией и определяться оптикой используемого конфокального лазерного сканирующего микроскопа . Это не радиальная ступенчатая функция, она также изменяется вдоль оси, перпендикулярной плоскости.
  3. Клетки, конечно, трехмерны, а не двумерны, как обесцвеченный объем. Пренебрежение диффузией из плоскости (мы принимаем ее за плоскость xy ) будет разумным приближением только в том случае, если флуоресценция восстанавливается преимущественно за счет диффузии в этой плоскости. Это будет верно, например, если отбелить цилиндрический объем с осью цилиндра вдоль оси z и с этим цилиндрическим объемом, проходящим через всю высоту ячейки. Тогда диффузия по оси z не вызывает восстановления флуоресценции, поскольку весь белок обесцвечивается равномерно по оси z , и поэтому пренебрежение им, как это делает уравнение Soumpasis, безвредно. Однако если диффузия по z ось действительно способствует восстановлению флуоресценции, поэтому ее необходимо учитывать.
  4. Нет никаких оснований ожидать, что цитоплазма или нуклеоплазма клетки будут полностью пространственно однородными или изотропными.

Таким образом, уравнение Soumpasis - всего лишь полезное приближение, которое можно использовать, когда перечисленные выше допущения являются хорошими приближениями к истинной ситуации, и когда восстановление флуоресценции действительно ограничено временной шкалой диффузии . Обратите внимание, что тот факт, что Soumpasis может быть адекватно приспособлен к данным, не обязательно означает, что предположения верны и что диффузия преобладает над восстановлением.

Восстановление с ограничением реакции [ править ]

Уравнение, описывающее флуоресценцию как функцию времени, особенно просто в другом пределе. Если большое количество белков связывается с сайтами в небольшом объеме, так что в сигнале флуоресценции преобладает сигнал от связанных белков, и если это связывание происходит в одном состоянии со скоростью k off , то флуоресценция как функция времени дается [14]

Обратите внимание, что восстановление зависит только от константы скорости отсоединения k off . Это не зависит от скорости привязки. Хотя это действительно зависит от ряда предположений [14]

  1. Скорость включения должна быть достаточно большой, чтобы локальная концентрация связанного белка значительно превышала локальную концентрацию свободного белка и, таким образом, позволяла пренебречь вкладом в f свободного белка.
  2. Реакция представляет собой простую бимолекулярную реакцию, при которой белок связывается с локализованными участками, которые не перемещаются значительно во время восстановления.
  3. Обмен происходит намного медленнее, чем диффузия (или какой-либо другой транспортный механизм, ответственный за подвижность), поскольку только тогда диффузионная фракция быстро восстанавливается, а затем действует как источник флуоресцентного белка, который связывает и заменяет связанный обесцвеченный белок и, таким образом, увеличивает флуоресценцию. Если r - радиус обесцвеченного пятна, это означает, что уравнение справедливо только при ограниченном сроке службы .

Если все эти предположения выполнены, то аппроксимация экспоненты кривой восстановления даст константу скорости отключения k off . Однако другая динамика может дать кривые восстановления, похожие на экспоненты, поэтому подгонка экспоненты не обязательно означает, что в восстановлении преобладает простая бимолекулярная реакция. Один из способов отличить восстановление со скоростью, определяемой развязкой, и восстановлением, которое ограничено диффузией, состоит в том, чтобы отметить, что скорость восстановления для восстановления, ограниченного связыванием, не зависит от размера обесцвеченной области r , в то время как она масштабируется как, для восстановления с ограничением диффузии. Таким образом, если отбеливаются небольшая и большая область, если восстановление ограничено отсоединением, то скорость восстановления будет одинаковой для двух размеров обесцвеченной области, тогда как если восстановление ограничено диффузией, то для большей отбеленной скорость будет намного медленнее. область.

Распространение и реакция [ править ]

В общем, восстановление флуоресценции не будет зависеть ни от простой изотропной диффузии, ни от одной простой скорости развязывания. Будет и диффузия, и связывание, и действительно, константа диффузии может быть неоднородной в пространстве, и может быть более одного типа сайтов связывания, и эти сайты также могут иметь неравномерное распределение в пространстве. Процессы потока также могут быть важны. Это более сложное поведение подразумевает, что для описания данных требуется модель с несколькими параметрами; модели только с одной константой диффузии D или с одной константой скорости выключения, k off , неадекватны.

Есть модели как с диффузией, так и с реакцией. [2] К сожалению, одна кривая FRAP может предоставить недостаточно доказательств для надежного и однозначного соответствия (возможно, зашумленных) экспериментальных данных. Садег Заде и др. [15] показали, что кривые FRAP могут быть подогнаны разными парами значений константы диффузии и постоянной скорости, или, другими словами, соответствие FRAP не является уникальным. Это трехпараметрическая подгонка (постоянная скорости, постоянная скорости и постоянная диффузии). Подгонки, которые не являются уникальными, обычно бесполезны.

Таким образом, для моделей с несколькими параметрами одного эксперимента FRAP может быть недостаточно для оценки всех параметров модели. Затем требуется больше данных, например, путем обесцвечивания областей разного размера [13], независимого определения некоторых параметров модели и т. Д.

См. Также [ править ]

  • Флуоресцентный микроскоп
  • Фотообесцвечивание
  • Потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP)

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б в Аксельрод, Д; Коппель, Д; Schlessinger, J; Элсон, Э; Уэбб, В. (1976). «Измерение подвижности путем анализа кинетики восстановления флуоресцентного фотообесцвечивания» . Биофизический журнал . 16 (9): 1055–69. Bibcode : 1976BpJ .... 16.1055A . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (76) 85755-4 . PMC  1334945 . PMID  786399 .
  2. ^ a b Sprague, Brian L .; Пего, Роберт Л .; Ставрева, Диана А .; МакНелли, Джеймс Г. (2004). «Анализ реакций связывания по восстановлению флуоресценции после фотообесцвечивания» . Биофизический журнал . 86 (6): 3473–95. Bibcode : 2004BpJ .... 86.3473S . DOI : 10.1529 / biophysj.103.026765 . PMC 1304253 . PMID 15189848 .  
  3. ^ a b c Коу Цинь; Чунмин Донг; Гуаню Ву; Невин Ламберт (август 2011 г.). «Предварительная сборка в неактивном состоянии рецепторов, связанных с Gq, и гетеротримеров Gq» . Природа Химическая биология . 7 (11): 740–747. DOI : 10.1038 / nchembio.642 . PMC 3177959 . PMID 21873996 .  
  4. ^ День, Калифорния; Крафт, ЖЖ; Канг, М; Кенуорти, АК (2012). «Анализ динамики белков и липидов с использованием восстановления конфокальной флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)» . Текущие протоколы цитометрии . Глава 2: 2–19. DOI : 10.1002 / 0471142956.cy0219s62 . PMC 3538152 . PMID 23042527 .  
  5. ^ Mazza, D; Мюллер, Ф; Стасевич, Т.Дж.; МакНелли, Дж. Г. (2013). «Конвергенция оценок связывания хроматина в живых клетках». Нат методы . 10 (8): 691–2. DOI : 10.1038 / nmeth.2573 . PMID 23900248 . S2CID 27896929 .  
  6. ^ Коу Цинь; Пуджа Р. Сетхи; Невин А. Ламберт (август 2008 г.). «Изобилие и стабильность комплексов, содержащих неактивные рецепторы, связанные с G-белками, и G-белки» . Журнал FASEB . 22 (8): 2920–2927. DOI : 10.1096 / fj.08-105775 . PMC 2493464 . PMID 18434433 .  
  7. ^ Крафт, LJ; Кенуорти, АК (2012). «Визуализация образования белковых комплексов в пути аутофагии: анализ взаимодействия LC3 и Atg4B (C74A) в живых клетках с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания» . J Biomed Opt . 17 (1): 011008. Bibcode : 2012JBO .... 17a1008K . DOI : 10.1117 / 1.JBO.17.1.011008 . PMC 3380812 . PMID 22352642 .  
  8. ^ Трипати, К; Парнаик, ВК (2008). «Дифференциальная динамика фактора сплайсинга SC35 во время клеточного цикла». Журнал биологических наук . 33 (3): 345–54. DOI : 10.1007 / s12038-008-0054-3 . PMID 19005234 . S2CID 6332495 .  
  9. ^ Houtsmuller, AB (2005). «Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания: приложение к ядерным белкам». Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии . 95 : 177–99. DOI : 10.1007 / b102214 . ISBN 978-3-540-23698-6. PMID  16080269 .
  10. ^ Soumpasis, D (1983). «Теоретический анализ экспериментов по восстановлению флуоресцентного фотообесцвечивания» . Биофизический журнал . 41 (1): 95–7. Bibcode : 1983BpJ .... 41 ... 95S . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (83) 84410-5 . PMC 1329018 . PMID 6824758 .  
  11. ^ Ян, J .; Köhler, K .; Дэвис, DM; Берроуз, штат Нью-Джерси (2009). «Усовершенствованный метод FRAP полосы для оценки коэффициентов диффузии: поправка на степень фотообесцвечивания». Журнал микроскопии . 238 (3): 240–53. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.2009.03347.x . PMID 20579262 . S2CID 21797777 .  
  12. ^ Замок, Брайан Т .; Говард, Стивен А .; Odde, Дэвид Дж. (2011). «Оценка транспортных механизмов, лежащих в основе градиента бикоидных морфогенов» . Клеточная и молекулярная биоинженерия . 4 (1): 116–121. DOI : 10.1007 / s12195-010-0157-4 . PMC 3164504 . PMID 21892361 .  
  13. ^ a b Гонсалес-Перес, Винисио; Шмирер, Бернхард; Хилл, Кэролайн С .; Sear, Ричард П. (2011). «Изучение динамики внутриядерной диффузии Smad2 с помощью математического моделирования экспериментов FRAP». Интегративная биология . 3 (3): 197–207. DOI : 10.1039 / c0ib00098a . PMID 21240396 . 
  14. ^ а б Булински, JC; Odde, DJ; Хауэлл, Би Джей; Лосось, ТД; Уотерман-Сторер, CM (2001). «Быстрая динамика связывания микротрубочек энсконсина in vivo». Журнал клеточной науки . 114 (Pt 21): 3885–97. PMID 11719555 . 
  15. ^ Sadegh заде, Kouroush; Montas, Hubert J; Ширмохаммади, Адель (2006). «Идентификация биомолекул масс-транспорта и параметров скорости связывания в живых клетках с помощью обратного моделирования» . Теоретическая биология и медицинское моделирование . 3 : 36. DOI : 10,1186 / 1742-4682-3-36 . PMC 1635038 . PMID 17034642 .