Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Для использования в других целях, см Фрагментация (значения) .

В клеточной биологии способы, которыми фрагментация полезна для клетки: клонирование ДНК и апоптоз. Клонирование ДНК важно для бесполого воспроизводства или создания идентичных молекул ДНК и может выполняться клеткой спонтанно или намеренно лабораторными исследователями. Апоптоз - это запрограммированное разрушение клеток и молекул ДНК внутри них, и это строго регулируемый процесс. Эти два способа использования фрагментации в клеточных процессах описывают нормальные клеточные функции и общие лабораторные процедуры, выполняемые с клетками. Однако проблемы внутри клетки иногда могут вызывать фрагментацию, которая приводит к нарушениям, таким как фрагментация эритроцитов и фрагментация ДНК сперматозоидов.

Клонирование ДНК [ править ]

Клонирование ДНК может выполняться клеткой спонтанно в репродуктивных целях. Это форма бесполого размножения, при которой организм распадается на фрагменты, а затем каждый из этих фрагментов превращается в зрелых, полностью выросших особей, которые являются клонами исходного организма (см. Раздел « Репродуктивная фрагментация» ). Клонирование ДНК также может быть выполнено намеренно лабораторными исследователями. Здесь фрагментация ДНК - это молекулярно-генетический метод, который позволяет исследователям использовать технологию рекомбинантной ДНК для получения большого количества идентичных молекул ДНК. Для завершения клонирования ДНК необходимо получить отдельные небольшие участки ДНК организма, которые составляют определенные гены.. В любой доступный вектор можно клонировать только относительно небольшие молекулы ДНК . Следовательно, длинные молекулы ДНК, составляющие геном организма, должны быть расщеплены на фрагменты, которые можно вставить в векторную ДНК. [1] Два фермента способствуют производству таких рекомбинантных молекул ДНК:

1. Рестрикционные ферменты
Рестрикционные ферменты - это эндонуклеазы, продуцируемые бактериями, которые обычно распознают небольшие последовательности пар оснований (называемые сайтами рестрикции ), а затем расщепляют обе нити ДНК в этом сайте. [2] Сайт рестрикции обычно представляет собой палиндромную последовательность , что означает, что последовательность сайта рестрикции одинакова на каждой цепи ДНК при считывании в направлении от 5 'к 3'.
Для каждого рестрикционного фермента бактерии также производят модифицирующий фермент, чтобы собственная ДНК бактерии-хозяина была защищена от расщепления. Это делается путем модификации ДНК хозяина на каждом потенциальном сайте расщепления или рядом с ним. Фермент модификации добавляет метильную группу к одному или двум основаниям, и присутствие этой метильной группы предотвращает разрезание ДНК эндонуклеазой рестрикции. [3]
А
Обрез, который создает липкий конец
А
Обрез, создающий тупой конец
Многие рестрикционные ферменты делают ступенчатые разрезы в двух цепях ДНК на их сайте узнавания, что приводит к образованию фрагментов с однонитевым «хвостом», выступающим с обоих концов, называемым липким концом. Ферменты рестрикции также могут делать прямые разрезы в двух цепях ДНК в их сайте узнавания, что приводит к образованию тупых концов. [4]
2. ДНК-лигаза
Во время нормальной репликации ДНК ДНК-лигаза катализирует сквозное соединение (лигирование) коротких фрагментов ДНК, называемых фрагментами Окадзаки . В целях клонирования ДНК очищенная ДНК-лигаза используется для ковалентного соединения концов рестрикционного фрагмента и векторной ДНК, которые имеют комплементарные концы. Они ковалентно лигированы вместе через стандартные 3 '- 5' фосфодиэфирные связи ДНК. [5]
ДНК-лигаза может лигировать комплементарные липкие и тупые концы , но лигирование тупых концов неэффективно и требует более высокой концентрации как ДНК, так и ДНК-лигазы, чем лигирование липких концов. [6] По этой причине большинство рестрикционных ферментов, используемых при клонировании ДНК, делают неровные разрезы в цепях ДНК для образования липких концов.

Ключом к клонированию фрагмента ДНК является его соединение с молекулой векторной ДНК, которая может реплицироваться в клетке-хозяине. После того, как единственная рекомбинантная молекула ДНК (состоящая из вектора плюс вставленный фрагмент ДНК) введена в клетку-хозяин, вставленная ДНК может реплицироваться вместе с вектором, создавая большое количество идентичных молекул ДНК. [7] Базовую схему для этого можно резюмировать следующим образом:

Вектор + фрагмент ДНК
↓
Рекомбинантная ДНК
↓
Репликация рекомбинантной ДНК внутри клетки-хозяина
↓
Выделение, секвенирование и манипуляции с очищенным фрагментом ДНК

Есть множество экспериментальных вариаций этой схемы, но эти шаги необходимы для клонирования ДНК в лаборатории. [8]

Апоптоз [ править ]

Фрагментация - это третий и последний этап разборки клеток во время апоптоза (правая часть схемы). [9]

Апоптоз означает гибель клеток в результате определенной формы запрограммированной гибели клеток , характеризующейся четко определенной последовательностью морфологических изменений. [10] Сокращение клеток и ядер, конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптотических телец и фагоцитоз соседними клетками характеризуют основные морфологические изменения в процессе апоптоза. [11] Обширные морфологические и биохимические изменения во время апоптоза гарантируют, что умирающие клетки оказывают минимальное воздействие на соседние клетки и / или ткани.

Гены, участвующие в контроле гибели клеток, кодируют белки с тремя различными функциями: [12]

  • Белки-убийцы необходимы клетке, чтобы начать процесс апоптоза.
  • Белки "разрушения" выполняют такие функции, как переваривание ДНК в умирающей клетке.
  • Белки "поглощения" необходимы для фагоцитоза умирающей клетки другой клеткой.

Расщепление хромосомной ДНК на более мелкие фрагменты является неотъемлемой частью и биохимическим признаком апоптоза. Апоптоз включает активацию эндонуклеаз с последующим расщеплением ДНК хроматина на фрагменты из 180 пар оснований или кратные 180 парам оснований (например, 360, 540). Этот образец фрагментации можно использовать для обнаружения апоптоза в таких тестах, как анализ лестничной ДНК с гель-электрофорезом , анализ TUNEL или анализ Николетти . [13] Апоптотическая фрагментация ДНК зависит от фермента, называемого каспазо-активируемой ДНКазой (CAD) . [14] CAD обычно подавляется другим белком в клетке, называемымИнгибитор каспазо-активируемой ДНКазы (ICAD) . [15] Для того, чтобы начался апоптоз, фермент каспаза 3 расщепляет ICAD, в результате чего CAD активируется. CAD затем расщепляет ДНК между нуклеосомами , которые находятся в хроматине с интервалами 180 пар оснований. Сайты между нуклеосомами - единственные части ДНК, которые открыты и доступны для CAD. [16]

Нарушения [ править ]

Фрагментация ДНК может происходить при определенных условиях в нескольких различных типах клеток. Это может привести к проблемам для клетки или к тому, что клетка получит сигнал о прохождении апоптоза. Ниже приведены несколько примеров нерегулярной фрагментации, которая может происходить в клетках.

1. Фрагментация красных кровяных телец.
Мазок крови пациента с гемолитической анемией, показывающий шистоциты
Фрагментированный эритроцит известен как шистоцит и обычно является результатом внутриклеточного механического повреждения эритроцита. [17] Может наблюдаться широкий спектр шистоцитов. Шистоциты обычно встречаются в относительно небольшом количестве и связаны с состояниями, при которых обычно гладкая эндотелиальная выстилка или эндотелий шероховатая или неровная, и / или просвет сосуда пересекается нитями фибрина . [18] Шистоциты обычно обнаруживаются у пациентов с гемолитической анемией . Они также являются признаком продвинутой железодефицитной анемии., но в этом случае наблюдаемая фрагментация, скорее всего, является результатом хрупкости клеток, полученных в этих условиях.
2. Фрагментация ДНК сперматозоидов.
В среднем у мужчины менее 4% его сперматозоидов будут содержать фрагментированную ДНК. Однако такие поступки, как курение, могут значительно увеличить фрагментацию ДНК в сперматозоидах. Существует отрицательная корреляция между процентом фрагментации ДНК и подвижностью, морфологией и концентрацией сперматозоидов. Существует также отрицательная связь между процентом сперматозоидов, содержащих фрагментированную ДНК, и скоростью оплодотворения и скоростью дробления эмбриона. [19]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Print.
  2. ^ Рао, Desirazu Н., Свати Саа и Vinita Кришнамурти. «АТФ-зависимые рестрикционные ферменты». Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии 64 (2000): 1-63. Распечатать.
  3. ^ Рао, Desirazu Н., Свати Саа и Vinita Кришнамурти. «АТФ-зависимые рестрикционные ферменты». Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии 64 (2000): 1-63. Распечатать.
  4. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Print.
  5. ^ Томкинсон, Алан Э. и Закари Б. Макки. «Структура и функция ДНК-лигаз млекопитающих». Исследование мутаций / Восстановление ДНК 407.1 (1998): 1-9. Распечатать.
  6. ^ Хунг, Mien-Чие , и Питер С. Wensink. «Различные липкие концы ДНК, генерируемые рестрикционными ферментами, могут быть соединены in vitro». Nucleic Acids Research 12.4 (1984): 1863-874. Распечатать.
  7. ^ "Ch 20." Avonapbio /. Np, nd Web. 20 ноября 2012 г. < http://avonapbio.pbworks.com/w/page/9429274/Ch%2020 >.
  8. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Print.
  9. ^ Смит, Аарон; Паркс, Майкл А.Ф.; Аткин-Смит, Джорджия К; Тиксейра, Рошель; Пун, Иван Х. «Разборка клеток при апоптозе» . WikiJournal of Medicine . 4 (1). DOI : 10.15347 / wjm / 2017.008 .
  10. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Print.
  11. ^ Хуа, Xhang J., и Ming Xu. «Фрагментация ДНК при апоптозе». Cell Research 10 (2000): 205-11. Природа. 17 июля 2000 г. Web. 19 ноября 2012 г.
  12. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Print.
  13. ^ Бортнер, Карл Д., Никлас Б. Е. Ольденбург и Джон А. Сидловски. «Роль фрагментации ДНК в апоптозе». Тенденции в клеточной биологии 5.1 (1995): 21-26. Распечатать.
  14. ^ Jog, Neelakshi Р., Lorenza Frisoni, Цинь Ши, Марк Monestier, Sairy Hernandez, Джо Крафт, Элин Т. Luning Prak и Роберто Caricchio. «Активированная каспазой ДНКаза необходима для поддержания толерантности к ядерным аутоантигенам волчанки». Артрит и ревматизм 64.4 (2012): 1247-256. Распечатать.
  15. ^ Кучер, Даниил, Альфред Pingoud, Альберт Jeltsch, и Грегор Meiss. «Идентификация полученных из ICAD пептидов, способных ингибировать ДНКазу, активируемую каспазой». Журнал FEBS 279.16 (2012): 2917-928. Распечатать.
  16. ^ Бортнер, Карл Д., Никлас Б. Е. Ольденбург и Джон А. Сидловски. «Роль фрагментации ДНК в апоптозе». Тенденции в клеточной биологии 5.1 (1995): 21-26. Распечатать.
  17. ^ Бессман, JD. «Фрагментация красных кровяных телец. Улучшенное обнаружение и идентификация причин». Американский журнал клинической патологии 90.3 (1988): 268-73. Распечатать.
  18. ^ "Шистоциты". Шистоциты. Np, nd Web. 20 ноября 2012 г. < http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/rbcmorph/schisto.htm >.
  19. ^ ВС, JG, А. Jurisicova и РФ Casper. «Обнаружение фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты в человеческой сперме: корреляция с оплодотворением in vitro». Биология размножения 56.3 (1997): 602-07. Распечатать.