Анализ гибридизации включает любую форму поддающейся количественной оценке гибридизации, то есть количественный отжиг двух комплементарных цепей нуклеиновых кислот , известный как гибридизация нуклеиновых кислот . [1]
Обзор
В контексте биохимии и разработки лекарств анализ гибридизации представляет собой тип анализа связывания лиганда (LBA), используемый для количественного определения нуклеиновых кислот в биологических матрицах. Анализы гибридизации могут проводиться в растворе или на твердом носителе, таком как 96-луночные планшеты или меченые шарики.
Анализы гибридизации включают меченые зонды нуклеиновых кислот для идентификации родственных молекул ДНК или РНК (т.е. со значительно высокой степенью сходства последовательностей) в сложной смеси немеченых молекул нуклеиновых кислот . Антисмысловая терапия , миРНК и другие биотерапевтические средства на основе олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот могут быть количественно определены с помощью анализов гибридизации.
Сигнализация методов гибридизации может осуществляться с использованием олигонуклеотидных зондов, модифицированных в процессе синтеза гаптенами и низкомолекулярными лигандами, которые действуют гомологично захватывающим и детектирующим антителам. Как и в традиционном ELISA , в качестве вторичных антител можно использовать конъюгаты с пероксидазой хрена (HRP) или щелочной фосфатазой (AP).
Анализ сэндвич-гибридизации
В формате анализа ELISA сэндвич-гибридизации антиген-лиганд и антитела в ELISA заменяются анализируемым веществом нуклеиновой кислоты, комплементарными зондами для захвата и обнаружения олигонуклеотидов. [2]
Как правило, в случае гибридизации нуклеиновой кислоты концентрацию одновалентной соли и температуру контролируют для гибридизации и строгости отмывки, в отличие от традиционного ELISA, где концентрация соли обычно фиксируется для стадий связывания и отмывки (т.е. PBS или TBS). Таким образом, оптимальная концентрация соли в анализах гибридизации варьируется в зависимости от длины и основного состава анализируемого вещества, зондов захвата и обнаружения.
Конкурентный анализ гибридизации
Конкурентный анализ гибридизации [3] аналогичен традиционному конкурентному иммуноанализу . Как и другие методы гибридизации, он основан на комплементарности, когда зонд захвата конкурирует между анализируемым веществом и индикатором - меченым аналогом олигонуклеотида с анализируемым веществом.
Анализ гибридизации-лигирования
В анализе гибридизации-лигирования [4] [5] шаблонный зонд заменяет захватывающий зонд в сэндвич-анализе для иммобилизации на твердой подложке. Матричный зонд полностью комплементарен олигонуклеотидному аналиту и предназначен для использования в качестве субстрата для лигирования, опосредованного ДНК-лигазой Т4 . Зонд-матрица дополнительно имеет дополнительный участок, комплементарный зонду лигирования, так что зонд лигирования будет лигироваться на 3'-конец анализируемого вещества. Зонд для лигирования, хотя и является общим, похож на зонд обнаружения в том, что он помечен, например, дигоксигенином для передачи сигналов ниже по течению. Строгая промывка с низким содержанием соли / без соли удалит не лигированные продукты.
Связывание анализируемого вещества с зондом для лигирования делает метод специфичным для 3'-конца анализируемого вещества, лигирование ДНК-лигазой Т4 намного менее эффективно по петле выпуклости, что могло бы произойти для 3'-метаболита N-1 версии аналит, например. Специфичность анализа гибридизации-лигирования для лигирования на 3'-конце особенно важна, потому что преобладающими нуклеазами в крови являются экзонуклеазы от 3 'до 5' .
Одним из ограничений метода является то, что он требует свободного 3'-концевого гидроксила, который может быть недоступен, например, когда нацеливающие фрагменты присоединены к 3'-концу. Кроме того, более экзотический химический состав нуклеиновых кислот с олигонуклеотидными лекарственными средствами может влиять на активность лигазы, которую необходимо определять в каждом конкретном случае.
Анализ гибридизации с двойным лигированием
Анализ гибридизации с двойным лигированием (DLA) [6] расширяет специфичность анализа гибридизации-лигирования до конкретного метода для исходного соединения. Несмотря на надежность, чувствительность и дополнительную специфичность анализа гибридизации-лигирования для 3'-конца олигонкулеотидного аналита, анализ гибридизации-лигирования не специфичен для 5'-конца аналита.
DLA предназначен для количественного определения только полноразмерного исходного олигонуклеотидного соединения с интактными 5 'и 3' концами. DLA зонды лигировали на 5' - и 3' - концах аналита совместным действием ДНК - лигазы Т4 и Т4 полинуклеотид - киназы . Киназа фосфорилирует 5'-конец анализируемого вещества, и лигаза присоединяет зонд захвата к аналиту и зонду обнаружения. Таким образом, зонды захвата и обнаружения в DLA можно назвать зондами лигирования. Что касается анализа гибридизации-лигирования, DLA специфичен для исходного соединения, потому что эффективность лигирования над петлей выпуклости низкая, и, таким образом, DLA обнаруживает полноразмерный аналит с интактными 5'- и 3'-концами. DLA также можно использовать для определения индивидуальных метаболитов в биологических матрицах.
Ограничения анализа гибридизации-лигирования также применимы к анализу двойного лигирования, когда 5'-конец в дополнение к 3'-концу требует наличия свободного гидроксила (или фосфатной группы). Кроме того, ДНК-лигазы Т4 несовместимы с лигированием молекул РНК в качестве донора (т.е. РНК на 5'-конце лигирования). Следовательно, антисмысловые кислоты второго поколения, которые содержат 2'-O-метил РНК, 2'-O-метоксиэтил или заблокированные нуклеиновые кислоты, могут быть несовместимы с анализом двойного лигирования.
Анализ гибридизации нуклеаз
Анализ нуклеазной гибридизации [7] [8], также называемый анализом разрезания нуклеазы S1 , представляет собой гибридизационный ELISA, основанный на анализе нуклеазной защиты . В анализе используется нуклеаза S1 , которая расщепляет одноцепочечные ДНК и РНК на олиго- или мононуклеотиды, оставляя нетронутыми двухцепочечные ДНК и РНК.
В анализе нуклеазной гибридизации олигонуклеотидный аналит захватывается твердой подложкой, такой как 96-луночный планшет, с помощью полностью комплементарного режущего зонда. После ферментативной обработки нуклеазой S1 свободный режущий зонд и режущий зонд гибридизуются с метаболитами, то есть короткоживущие вещества анализируемого вещества разлагаются, что позволяет генерировать сигнал только от дуплекса полноразмерный разрезанный зонд-аналит.
Анализ хорошо толерантен к различным химическим веществам, что подтверждается разработкой нуклеазного анализа для морфолиноолигонуклеотидов . [9]
Этому анализу может не хватать надежности и он не подходит для валидации в соответствии с рекомендациями FDA по валидации биоаналитических методов . Об этом свидетельствует отсутствие опубликованных методов, которые были подтверждены в соответствии со стандартами, установленными FDA для биоаналитических методов.
Рекомендации
- ^ ким, Калицис, джи хун, пол; и другие. «Нуклеиновые кислоты: гибридизация» . хитрый . Проверено 4 февраля 2017 года .
- ^ Эфлер, С.М. Zhang, L .; Нолл, БО; Uhlmann, E .; Дэвис, Х.Л. (2005), «Количественная оценка олигодезоксинуклеотидов в плазме человека с помощью нового анализа гибридизации предлагает значительно повышенную чувствительность по сравнению с электрофорезом в капиллярном геле», Олигонуклеотиды , 15 (2): 119–131, doi : 10.1089 / oli.2005.15.119 , PMID 15989426
- ^ Деверре, Жан-Робер; Буте, Валери; Боке, Дидье; Эзан, Эрик; Грасси, Жак; Grognet, Жан-Марк (1997), "Конкурентный ферментный анализ гибридизации для определения плазмы фосфодиэфирных и фосфоротиоатная антисмысловых олигонуклеотидов", Nucleic Acids Research , 25 (18): 3584-3589, DOI : 10,1093 / NAR / 25.18.3584 , КУП 146941 , PMID 9278477[ мертвая ссылка ]
- ^ Деверре, Жан-Робер; Буте, Валери; Боке, Дидье; Эзан, Эрик; Грасси, Жак; Grognet, Жан-Марк (1997), "Конкурентный ферментный анализ гибридизации для определения плазмы фосфодиэфирных и фосфоротиоатная антисмысловых олигонуклеотидов", Nucleic Acids Research , 25 (18): 3584-3589, DOI : 10,1093 / NAR / 25.18.3584 , КУП 146941 , PMID 9278477[ мертвая ссылка ]
- ^ B1 Патент США 6355438 B1 , Бренда Ф. Бейкер; Чжэнронг Ю. и Джанет М. Лидс, "Метод количественного определения олигонуклеотидов", опубликовано 12 марта 2002 г., передано Isis Pharmaceuticals, Inc.
- ^ Tremblay, Guy A .; Халафагян, Гарине; Лего, Джули; Bartlett, Алан (март 2011), "двойной перевязки гибридизация тест для определения специфической олигонуклеотидных терапии", Биоанализ , 3 (5): 499-508, DOI : 10,4155 / bio.11.18 , PMID 21388263
- ^ Патент США 8163477 , Zhengrong Yu; Бренда Ф. Бейкер и Хунцзян Ву, «Метод на основе нуклеаз для обнаружения и количественного определения олигонуклеотидов», опубликовано 24 апреля 2012 г., передано Isis Pharmaceuticals, Inc.
- ^ Сяохуэй, Вэй; Дай, Гуовэй; Маркучи, Гвидо; Лю, Чжунфа; Хойт, Дейл; Блюм, Уильям; Чан, Кеннет К. (2006), "Конкретная пикомолярная Гибридизация-основа ELISA анализ для определения фосфотиоатных олигонуклеотидов в плазме крови и клеточной матрице", Pharmaceutical Research , 23 (6): 1251-1264, DOI : 10.1007 / s11095-006 -0082-3 , PMID 16718617
- ^ Бурки, Умар; Кин, Джонатан; Блейн, Элисон; О'Донован, Лиз; Походка, Майкл Дж .; Лаваль, Стивен Х .; Строб, Фолькер (2015), «Разработка и применение ультрачувствительная Гибридизация на основе ELISA Метод определения пептидных-конъюгированные Phosphorodiamidate морфолино олигонуклеотидов», Нуклеиновые Кислоты Therapeutics , 25 (5): 275-284, DOI : 10,1089 / физ. 2014.0528 , PMC 4576940 , PMID 26176274