Множественные циклы отжига и циклической амплификации ( MALBAC ) - это квазилинейный метод амплификации всего генома . В отличие от обычных методов амплификации ДНК, которые являются нелинейными или экспоненциальными (в каждом цикле скопированная ДНК может служить в качестве матрицы для последующих циклов), MALBAC использует специальные праймеры, которые позволяют ампликонам иметь комплементарные концы и, следовательно, образовывать петли, предотвращая экспоненциальное копирование ДНК. . Это приводит к амплификации только исходной геномной ДНК и, следовательно, снижает систематическую ошибку амплификации. MALBAC «используется для создания перекрывающихся ампликонов дробовика, покрывающих большую часть генома». [1] Для секвенирования следующего поколения за MALBAC следует регулярная ПЦР. который используется для дальнейшего усиления ампликонов.
Технологическая платформа
До MALBAC отдельную клетку выделяли различными методами, включая микродиссекцию с лазерным захватом , микрофлюидные устройства, проточную цитометрию или микропипетирование, а затем лизировали. Одноклеточная полногеномная амплификация MALBAC включает 5 циклов гашения, удлинения, плавления и образования петель.
Праймеры MALBAC
Основное преимущество MALBAC состоит в том, что ДНК амплифицируется почти линейно. Использование специализированных праймеров позволяет образовывать петли ампликонов, что предотвращает их дальнейшую амплификацию в последующих циклах MALBAC. Эти праймеры имеют длину 35 нуклеотидов, с 8 вариабельными нуклеотидами, которые гибридизуются с матрицами, и 27 общими нуклеотидами. [1] Общая нуклеотидная последовательность - GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG. 8 вариабельных нуклеотидов случайным образом отжигаются с одноцепочечной молекулой геномной ДНК. После одного удлинения получается полуампликон, ампликон, содержащий общую нуклеотидную последовательность только на 5'-конце. Этот полуампликон используется в качестве шаблона для другого раунда расширения, в результате чего получается полный ампликон, ампликон, в котором 3'-конец комплементарен последовательности на 5'-конце.
Смещение прядей
Праймеры MALBAC имеют переменные компоненты, которые позволяют им случайным образом связываться с матричной ДНК. Это означает, что на одном фрагменте в любом цикле может быть несколько праймеров, отожженных к фрагменту. ДНК - полимераза , такие как один , полученные из Bacillus stearothermophilus ( Bst - полимеразы) способно вытеснять конец другой нити вверх по течению , растущей в том же направлении 5' . [2]
Частота ошибок
Bst ДНК-полимераза имеет частоту ошибок 1/10000 оснований. [3]
Экспериментальный рабочий процесс
- Выделение и лизис одной клетки - пг фрагментов геномной ДНК (от 10 до 100 т.п.н.), выделенных из одной клетки, используются в качестве матриц.
- Плавление - при 94 ° C двухцепочечные молекулы ДНК плавятся в одноцепочечные формы.
- Гашение - после плавления реакцию немедленно гасят до 0 ° C и в реакцию добавляют праймеры MALBAC.
- Удлинение - ДНК-полимераза Bst (большой фрагмент) удлиняет праймеры при 65 ° C в течение 2 минут, создавая полуампликоны.
- Плавление . Реакционную смесь нагревают до 94 ° C для отделения полуампликона от матрицы геномной ДНК.
- Гашение - реакцию быстро гасят при 0 ° C, после чего добавляют ту же смесь полимераз. Праймеры MALBAC эффективно связываются как с полуампликонами, так и с матрицей геномной ДНК.
- Удлинение - ДНК-полимераза Bst (большой фрагмент) удлиняет праймеры при 65 ° C в течение 2 минут. На этом этапе создаются полные ампликоны для тех, которые использовали полуампликоны в качестве матриц, а также полуампликоны для тех, которые использовали матрицу геномной ДНК в качестве матриц.
- Плавление . Реакционную смесь нагревают до 94 ° C, чтобы отделить ампликоны от матрицы.
- Зацикливание - для полных ампликонов последовательность 3 'конца теперь дополняет 5' конец. При 58 ° C два конца гибридизуются, образуя петлю ДНК. Это предотвращает использование полного ампликона в качестве шаблона в последующих циклах MALBAC.
- Повторите шаги 6-9 пять раз - 5 циклов линейного усиления MALBAC.
- Регулярная ПЦР - продукт MALBAC дополнительно амплифицируется с помощью ПЦР. Используя 27 общих нуклеотидов в качестве праймеров, амплифицируются только полные ампликоны.
В конце ПЦР пикограммы генетического материала амплифицируются до микрограмма ДНК, что дает достаточно ДНК для секвенирования.
Приложения
MALBAC предлагает беспристрастный подход к амплификации ДНК из одной клетки. Этот метод секвенирования отдельных клеток имеет огромное количество приложений, многие из которых еще предстоит использовать. MALBAC может помочь в анализе судебно-медицинских образцов, в пренатальном скрининге на генетические заболевания, в понимании развития репродуктивных клеток или в выяснении сложности опухоли. [1] [4] По сути, эта технология позволяет исследователям наблюдать за частотой, с которой мутации накапливаются в отдельных клетках. [1] Кроме того, он позволяет обнаруживать хромосомные аномалии и вариации числа копий генов (CNV) внутри и между клетками, а также облегчает обнаружение необычных мутаций, которые приводят к однонуклеотидным полиморфизмам (SNP). [1]
В области исследования рака MALBAC имеет множество применений. Его можно использовать для изучения внутриопухолевой гетерогенности, для идентификации генов, которые могут вызывать агрессивный или метастатический фенотип, или для оценки возможности развития у опухоли лекарственной устойчивости . [4] [5] Новаторское применение MALBAC было опубликовано в декабрьском выпуске журнала Science за 2012 г. и описывало использование этой технологии для измерения скорости мутации линии клеток рака толстой кишки SW4802. [1] Посредством секвенирования амплифицированной ДНК трех родственных клеток рака толстой кишки параллельно с неродственными клетками рака толстой кишки из другой линии, SNP были идентифицированы без обнаружения ложных срабатываний. [1] Было также замечено, что трансверсии пурин-пиримидин происходят с высокой частотой среди SNP. [1] Характеристика числа копий и вариаций одиночных нуклеотидов одиночных раковых клеток толстой кишки подчеркнула гетерогенность, присутствующую в опухоли. [1]
MALBAC применялся как метод изучения генетического разнообразия репродуктивных клеток. Посредством секвенирования геномов 99 отдельных сперматозоидов человека от анонимного донора MALBAC был использован для изучения событий генетической рекомбинации с участием отдельных гамет и, в конечном итоге, для понимания динамики генетической рекомбинации и ее вклада в мужское бесплодие. [6] Кроме того, в отдельном сперматозоиде MALBAC идентифицировал дублированные или отсутствующие хромосомы, а также SNP или CNV, которые могли отрицательно повлиять на фертильность. [6]
Преимущества
MALBAC привел ко многим значительным достижениям по сравнению с другими методами секвенирования отдельных клеток, прежде всего в том, что он может определять 93% генома отдельной клетки человека. [1] Некоторые преимущества этой технологии включают снижение систематической ошибки амплификации и увеличение охвата генома , требование очень небольшого количества матричной ДНК и низкий уровень ложноположительных и ложноотрицательных мутаций. [4] [6]
Снижает систематическую ошибку амплификации и увеличивает охват генома
MALBAC - это форма секвенирования всего генома, которая снижает систематическую ошибку, связанную с экспоненциальной амплификацией ПЦР, за счет использования квазилинейной фазы предварительной амплификации. [1] MALBAC использует пять циклов предварительной амплификации и праймеры, содержащие общую последовательность из 27 нуклеотидов и вариабельную последовательность из 8 нуклеотидов, для получения фрагментов амплифицированной ДНК (ампликонов), которые образуют петлю, чтобы предотвратить дополнительное копирование и перекрестную гибридизацию. [1] [7] Эти петли нельзя использовать в качестве матрицы для амплификации во время MALBAC и, следовательно, уменьшить смещение амплификации, обычно связанное с неравномерной экспоненциальной амплификацией фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции. [1] Было описано, что MALBAC имеет лучшую однородность амплификации, чем другие методы однократного секвенирования, такие как многократная амплификация смещения (MDA). [1] [5] MDA не использует петли ДНК и амплифицирует ДНК экспоненциально, что приводит к смещению. [1] Соответственно, систематическая ошибка амплификации, связанная с другими методами секвенирования отдельных клеток, приводит к низкому охвату генома. [1] [5] Уменьшение систематической ошибки, связанной с MALBAC, привело к лучшему охвату последовательностей генома, чем другие методы секвенирования отдельных клеток.
Требуется очень мало шаблонной ДНК
MALBAC можно использовать для амплификации и последующего секвенирования ДНК, когда доступна только одна или несколько клеток, например, при анализе циркулирующих опухолевых клеток, пренатальных скринингах или судебно-медицинских образцах. [4] [7] Для запуска процесса требуется лишь небольшое количество исходной матрицы (пикограммы ДНК), поэтому это идеальный метод для секвенирования отдельной клетки человека. [1]
Низкая частота ложноположительных и ложноотрицательных мутаций
Секвенирование отдельных клеток часто имеет высокий уровень ложноотрицательных мутаций. [1] Частота ложноотрицательных мутаций определяется как вероятность того, что настоящая мутация не будет обнаружена, и это может произойти из-за смещения амплификации в результате потери или выпадения аллеля. [8] Равномерность покрытия последовательности MALBAC по сравнению с другими методами секвенирования отдельных клеток улучшила обнаружение SNP и снизила частоту выпадения аллелей . [1] Частота выпадения аллелей увеличивается, когда аллель гетерозиготы не может амплифицироваться, что приводит к идентификации «ложной гомозиготы». Это может происходить из-за низкой концентрации матрицы ДНК или неравномерной амплификации матрицы, в результате которой один аллель гетерозиготы копируется больше, чем другой. [8] Показано, что процент выпадения аллеля MALBAC намного ниже (примерно 1%) по сравнению с MDA, который составляет примерно 65%. В отличие от MDA, эффективность обнаружения SNP которого составляет 41% по сравнению с массовым секвенированием, MALBAC, как сообщается, имеет эффективность обнаружения SNP 76%. [1] Сообщается также о низком уровне ложноположительных результатов MALBAC . Ложноположительные мутации, генерируемые MALBAC, в основном являются результатом ошибок, внесенных ДНК-полимеразой во время первого цикла амплификации, которые в дальнейшем распространяются в последующих циклах. Эту частоту ложных срабатываний можно устранить путем секвенирования 2-3 клеток в пределах линии, полученной от одной клетки, для проверки наличия SNP, а также путем устранения ошибок секвенирования и амплификации путем секвенирования неродственных клеток из отдельной линии. [1]
Ограничения
- Из-за потребности в небольшом количестве матричной ДНК загрязнение целевой ДНК оператором или окружающей средой может потенциально исказить результаты секвенирования. [1]
- Чтобы полностью исключить ложноположительные результаты, необходимо сравнить результаты секвенирования клеток с результатами, полученными от 2–3 клеток одного и того же клона, а также с клетками неродственного клона. [1]
- ДНК- полимераза, используемая для амплификации матричной ДНК, подвержена ошибкам и может вносить ошибки секвенирования в первый цикл MALBAC, которые впоследствии размножаются. [1] [4]
- Покрытие генома на уровне отдельной клетки с использованием MALBAC менее однородно, чем массовое секвенирование. Хотя MALBAC повысил эффективность обнаружения при секвенировании отдельных клеток, он не может обнаружить примерно одну треть SNP по сравнению с массовым секвенированием. [1] [4]
Внешние ссылки
- [1] База данных NCBI
- [2] Yikon Genomics: амплификация всего генома (WGA) и многократные циклы амплификации на основе отжига и зацикливания (MALBAC)
Рекомендации
- ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y Zong, C .; Lu, S .; Чапмен, АР; Се, С. (2012). «Общегеномное обнаружение однонуклеотидных вариаций и вариаций числа копий одной клетки человека». Science 338, 1622. DOI: 10.1126 / science.1229164. PMID 23258894
- ^ "Aviel-Ronen, S .; Qi Zhu, C .; Coe, BP; Liu, N .; Watson, SK; Lam, WL; Tsao, MS (2006)" Большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы для амплификации ДНК всего генома из фиксированных формалином залитых парафином тканей ». BMC Genomics 7. DOI: 10.1186 / 1471-2164-7-312. PMID 17156491
- ^ ТЕКУЩИЕ ПРОТОКОЛЫ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, Ausubel, FM et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc., 1995. Стр. 7.4.18.
- ^ Б с д е е Baker, M. (2012). «Метод предлагает схему единственной человеческой клетки». Новости природы. DOI : 10.1038 / nature.2012.12088
- ^ a b c Lu, S .; Zong, C .; Fan, W .; Ян, М .; Li, J .; Чапмен, АР; Zhu, P .; Ху, X .; Xu, L .; Ян, Л .; Bai, F .; Qiao, J .; Tang, F .; Li, R .; Се, С. (2012). «Исследование мейотической рекомбинации и анеуплоидии отдельных сперматозоидов путем секвенирования всего генома». Science 338, 1627. DOI: 10.1126 / science.1229112. PMID 23258895
- ^ a b Реуэлл, П. (2013). «Одна клетка - это все, что вам нужно - инновационная технология позволяет секвенировать весь геном из одной клетки». Harvard Gazette. http://news.harvard.edu/gazette/story/2013/01/one-cell-is-all-you-need/
- ^ a b Миллер, CR; Joyce, P .; Уэйтс, LP (2002). «Оценка выпадения аллелей и надежности генотипа с использованием максимального правдоподобия». Генетика 160 (1) 357-366. PMID 11805071