Множественная амплификация смещения (MDA) - это метод амплификации ДНК . Этот метод может быстро увеличить незначительное количество образцов ДНК до разумного количества для геномного анализа. Реакция начинается с отжига случайных гексамерных праймеров к матрице: синтез ДНК осуществляется высокоточным ферментом , предпочтительно ДНК-полимеразой Ф29 . По сравнению с обычными методами ПЦР- амплификации, MDA не использует праймеры, специфичные для последовательности, но амплифицирует всю ДНК, генерирует продукты большего размера с более низкой частотой ошибок и работает при постоянной температуре. MDA активно используется при амплификации всего генома.(WGA) и является многообещающим методом для применения в секвенировании генома одной клетки и генетических исследованиях на основе секвенирования.
Задний план
Многие биологические и судебно-медицинские исследования, связанные с генетическим анализом, требуют секвенирования ДНК из мельчайших количеств образца, например ДНК из некультивируемых отдельных клеток или следовых количеств ткани, собранных с мест преступления. Для методов амплификации ДНК на основе обычной полимеразной цепной реакции ( ПЦР ) требуются специфичные для последовательности олигонуклеотидные праймеры и термостабильная (обычно Taq ) полимераза , и их можно использовать для получения значительных количеств ДНК из мельчайших количеств ДНК. Однако этого недостаточно для современных методов, в которых используется анализ ДНК на основе секвенирования. Следовательно, необходим более эффективный метод, не зависящий от последовательности, для амплификации минимальных количеств ДНК, особенно в геномных исследованиях отдельных клеток.
Материалы
ДНК-полимераза Phi 29
ДНК-полимераза бактериофага Ф29 - это высокопроизводительный фермент , способный продуцировать ампликоны ДНК размером более 70 тысяч пар оснований. [1] Его высокая точность и активность проверки 3'– 5 'снижают частоту ошибок амплификации до 1 из 10 6 -10 7 оснований по сравнению с обычной полимеразой Taq с зарегистрированной частотой ошибок 1 из 9000. [2] Реакция может проводиться при умеренных изотермических условиях 30 ° C и, следовательно, не требует термоциклера . Он активно используется в бесклеточном клонировании, которое представляет собой ферментативный метод амплификации ДНК in vitro без культивирования клеток и экстракции ДНК . Большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst также используется в MDA, но обычно предпочтительнее использовать Ф29 из-за его достаточного выхода продукта и активности проверки. [3]
Праймеры гексамерные
Праймеры гексамера представляют собой последовательности, состоящие из шести случайных нуклеотидов . Для применения MDA эти праймеры обычно модифицируются тиофосфатом на их 3'-конце для передачи устойчивости к 3'-5'- экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы Ф29 . Реакции MDA начинаются с отжига таких праймеров на матрице ДНК с последующим удлинением цепи, опосредованным полимеразой. Во время реакции амплификации происходит увеличение числа событий отжига праймеров.
Реакция
Реакция амплификации начинается, когда несколько гексамеров праймеров отжигаются с матрицей. Когда синтез ДНК переходит к следующему стартовому сайту, полимераза замещает вновь образованную цепь ДНК и продолжает ее удлинение. Смещение цепи генерирует недавно синтезированную матрицу одноцепочечной ДНК для большего количества праймеров для отжига. Дальнейший отжиг праймеров и смещение цепи на вновь синтезированной матрице приводит к гиперразветвленной сети ДНК. Разветвление последовательности во время амплификации приводит к высокому выходу продуктов. Для разделения разветвленной сети ДНК используются нуклеазы S1, которые расщепляют фрагменты в местах смещения. В зарубки на полученных фрагментов ДНК ремонтируются ДНК - полимеразы I .
Качество продукции
MDA может генерировать 1-2 мкг ДНК из одной клетки с охватом генома до 99%. [4] Продукты также имеют меньшую частоту ошибок и большие размеры по сравнению с амплификацией Taq на основе ПЦР . [4] [5]
Общий рабочий процесс MDA: [6]
- Подготовка образцов : образцы собирают и разбавляют в соответствующем реакционном буфере (без Ca 2+ и Mg 2+ ). Клетки лизируют щелочным буфером .
- Условия : реакцию MDA с полимеразой Ф29 проводят при 30 ° C. Обычно реакция занимает около 2,5–3 часов.
- Конец реакции : инактивировать ферменты при 65 ° C перед сбором продуктов амплифицированной ДНК.
- Продукты ДНК можно очистить с помощью коммерческого набора для очистки.
Преимущества
MDA производит достаточный выход продуктов ДНК. Это мощный инструмент для амплификации молекул ДНК из образцов, таких как некультивируемые микроорганизмы или отдельные клетки, до количества, достаточного для исследований по секвенированию . Большой размер продуктов ДНК, амплифицированных MDA, также обеспечивает желаемое качество образца для определения размера аллелей полиморфных повторов. Его высокая точность также делает его надежным для использования при обнаружении аллелей однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Из-за смещения цепи во время амплификации амплифицированная ДНК имеет достаточный охват молекул исходной ДНК, что обеспечивает высококачественный продукт для геномного анализа. Продукты смещенных цепей можно впоследствии клонировать в векторы для создания библиотеки для последующих реакций секвенирования .
Ограничения
Аллельный выпад (ADO)
ADO определяется как случайное отсутствие амплификации одного из аллелей, присутствующих в гетерозиготной выборке. Некоторые исследования сообщают, что уровень ADO продуктов MDA составляет 0–60%. [7] Этот недостаток снижает точность генотипирования одного образца и ошибочный диагноз в других приложениях, связанных с MDA. ADO, по-видимому, не зависит от размеров фрагментов и, как сообщается, имеет аналогичную скорость в других одноклеточных методах. Возможными решениями являются использование различных условий лизиса или выполнение нескольких раундов амплификаций из разбавленных продуктов MDA, поскольку, как сообщалось, опосредованная ПЦР амплификация из культивированных клеток дает более низкие скорости ADO.
Предпочтительное усиление
«Предпочтительное усиление» - это чрезмерное усиление одного из аллелей по сравнению с другим. Большинство исследований MDA сообщают об этой проблеме. В настоящее время наблюдается случайная ошибка амплификации. Это может повлиять на анализ небольших участков геномной ДНК при идентификации аллелей коротких тандемных повторов (STR).
Праймер-праймерные взаимодействия
Эндогенное независимое от матрицы взаимодействие праймер-праймер обусловлено случайным дизайном гексамерных праймеров. Одним из возможных решений является создание ограниченно-рандомизированных гексануклеотидных праймеров, которые не подвергаются перекрестной гибридизации.
Приложения
Секвенирование генома одной клетки
Единичные клетки некультивируемых бактерий, архей и протистов, а также отдельные вирусные частицы и отдельные споры грибов были секвенированы с помощью MDA. [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]]
Способность секвенировать отдельные клетки также полезна в борьбе с болезнями человека. Геномы из отдельных эмбриональных клеток человека были успешно амплифицированы для секвенирования с использованием MDA, что позволяет проводить преимплантационную генетическую диагностику (PGD): скрининг генетических проблем со здоровьем на ранней стадии эмбриона перед имплантацией . [19] Заболевания с гетерогенными свойствами, такие как рак , также выигрывают от способности секвенирования генома на основе MDA изучать мутации в отдельных клетках.
Продукты MDA из одной клетки также успешно использовались в экспериментах по сравнительной геномной гибридизации с матрицами, которые обычно требуют относительно большого количества амплифицированной ДНК.
Иммунопреципитация хроматина
Иммунопреципитация хроматина приводит к образованию сложных смесей относительно коротких фрагментов ДНК, которые сложно амплифицировать с помощью MDA, не вызывая смещения в представлении фрагментов. Был предложен способ обхода этой проблемы, который основан на превращении этих смесей в кольцевые конкатемеры с использованием лигирования с последующим применением MDA, опосредованного ДНК-полимеразой Ф29. [20]
Судебно-медицинский анализ
Количество следов образцов, собранных с мест преступления, может быть увеличено с помощью MDA до количества, достаточного для судебно-медицинского анализа ДНК, который обычно используется для идентификации жертв и подозреваемых.
Смотрите также
- Полимеразной цепной реакции
- Амплификация всего генома
Рекомендации
- ^ Бланко л, Bernad А, Ласаро Дж.М., Мартин G, Garmendia С, М Салас (1989). «Высокоэффективный синтез ДНК ДНК-полимеразой фага phi 29. Симметричный режим репликации ДНК» . Журнал биологической химии . 264 (15): 8935–40. PMID 2498321 .
- ^ Тиндалл К.Р., Кункель Т.А. (1988). «Верность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Thermus aquaticus». Биохимия . 27 (16): 6008–13. DOI : 10.1021 / bi00416a027 . PMID 2847780 .
- ^ Хатчисон, Калифорния; Смит, Х.о .; Pfannkoch, C; Вентер, JC (2005). «Бесклеточное клонирование с использованием ДНК-полимеразы φ29» . Труды Национальной академии наук . 102 (48): 17332–6. Bibcode : 2005PNAS..10217332H . DOI : 10.1073 / pnas.0508809102 . PMC 1283157 . PMID 16286637 .
- ^ а б Паез Дж. Г., Лин М., Бероухим Р., Ли Дж. К., Чжао Х, Рихтер Д. Д., Габриэль С., Герман П., Сасаки Г., Альтшулер Д., Ли С., Мейерсон М., Продавцы В. Р. (2004). «Покрытие генома и точность последовательности основанной на phi29 полимеразы многонитевой амплификации всего генома» . Исследования нуклеиновых кислот . 32 (9): e71. DOI : 10.1093 / NAR / gnh069 . PMC 419624 . PMID 15150323 .
- ^ Эстебан Дж. А., Салас М., Бланко Л. (1993). «Верность ДНК-полимеразы phi 29. Сравнение инициации, примированной белком, и ДНК-полимеризации» . Журнал биологической химии . 268 (4): 2719–26. PMID 8428945 .
- ^ Вертел; Le Caignec, C; Де Рик, М; Ван Хот, Л; Ван Штайртегем, А; Либаерс, I; Проповедь, К. (2006). «Полногеномная амплификация множественного смещения из одиночных клеток». Протоколы природы . 1 (4): 1965–70. DOI : 10.1038 / nprot.2006.326 . PMID 17487184 . S2CID 33346321 .
- ^ Брэдли, Уорд, Ярборо (2012). «Показатели выпадения аллелей при многократном смещении амплификации». Прикладные биомолекулярные методы . 84 (51): 341–362.CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
- ^ Чжан; Мартини, AC; Реппас, Н.Б .; Барри, кВт; Малек, Дж; Чисхолм, ЮЗ; Церковь, GM (2006). «Секвенирование геномов из отдельных клеток путем клонирования полимеразы». Природа Биотехнологии . 24 (6): 680–6. DOI : 10.1038 / nbt1214 . PMID 16732271 . S2CID 2994579 .
- ^ Степанаускас, Рамунас; Серацки, Майкл Э. (22 мая 2007 г.). «Соответствие филогении и метаболизма некультивируемых морских бактерий, по одной клетке за раз» . Труды Национальной академии наук . 104 (21): 9052–9057. Bibcode : 2007PNAS..104.9052S . DOI : 10.1073 / pnas.0700496104 . ISSN 0027-8424 . PMC 1885626 . PMID 17502618 .
- ^ Юн, Хван Су; Прайс, Дана С .; Степанаускас, Рамунас; Rajah, Veeran D .; Sieracki, Michael E .; Уилсон, Уильям Х .; Ян, Ын Чан; Даффи, Сиобаин; Бхаттачарья, Дебашиш (06.05.2011). «Одноклеточная геномика выявляет органические взаимодействия у некультивируемых морских простейших». Наука . 332 (6030): 714–717. Bibcode : 2011Sci ... 332..714Y . DOI : 10.1126 / science.1203163 . ISSN 0036-8075 . PMID 21551060 . S2CID 34343205 .
- ^ Свон, Брэндон К .; Мартинес-Гарсия, Мануэль; Престон, Кристина М .; Щирба, Александр; Войке, Таня; Лами, Доминик; Рейнталер, Томас; Поултон, Николь Дж .; Масланд, Э. Дашиелл П. (02.09.2011). «Потенциал хемолитоавтотрофии среди повсеместных родословных бактерий в Темном океане». Наука . 333 (6047): 1296–1300. Bibcode : 2011Sci ... 333.1296S . DOI : 10.1126 / science.1203690 . ISSN 0036-8075 . PMID 21885783 . S2CID 206533092 .
- ^ Войке, Таня; Се, Гэри; Коупленд, Алекс; Гонсалес, Хосе М .; Хан, Клифф; Поцелуй, Хайналка; Пила, Джимми Х .; Сенин, Павел; Ян, Чи (2009-04-23). «Сборка морского метагенома, по одной клетке за раз» . PLOS ONE . 4 (4): e5299. Bibcode : 2009PLoSO ... 4.5299W . DOI : 10.1371 / journal.pone.0005299 . ISSN 1932-6203 . PMC 2668756 . PMID 19390573 .
- ^ Свон, Брэндон К .; Таппер, Бен; Щирба, Александр; Lauro, Federico M .; Мартинес-Гарсия, Мануэль; Гонсалес, Хосе М .; Ло, Хайвэй; Райт, Джоди Дж .; Лэндри, Захари К. (09.07.2013). «Преобладающая оптимизация генома и широтная дивергенция планктонных бактерий на поверхности океана» . Труды Национальной академии наук . 110 (28): 11463–11468. Bibcode : 2013PNAS..11011463S . DOI : 10.1073 / pnas.1304246110 . ISSN 0027-8424 . PMC 3710821 . PMID 23801761 .
- ^ Ринке, Кристиан; Швентек, Патрик; Щирба, Александр; Иванова Наталья Н .; Андерсон, Иэн Дж .; Ченг, Ян-Фанг; Дорогой, Аарон; Малфатти, Стефани; Свон, Брэндон К. (июль 2013 г.). «Понимание филогении и кодирующего потенциала микробной темной материи» . Природа . 499 (7459): 431–437. Bibcode : 2013Natur.499..431R . DOI : 10,1038 / природа12352 . ISSN 0028-0836 . PMID 23851394 .
- ^ Каштан, Надав; Roggensack, Sara E .; Родриг, Себастьен; Томпсон, Джесси В .; Биллер, Стивен Дж .; Коу, Эллисон; Дин, Хуйминь; Марттинен, Пекка; Мальмстрем, Рекс Р. (25 апреля 2014 г.). «Одноклеточная геномика выявляет сотни сосуществующих субпопуляций дикого прохлорококка». Наука . 344 (6182): 416–420. Bibcode : 2014Sci ... 344..416K . DOI : 10.1126 / science.1248575 . hdl : 1721,1 / 92763 . ISSN 0036-8075 . PMID 24763590 . S2CID 13659345 .
- ^ Уилсон, Уильям H; Гилг, Илана С; Монируззаман, Мохаммад; Филд, Эрин К. Корень, Сергей; LeCleir, Gary R; Мартинес Мартинес, Хоакин; Поултон, Николь Дж; Свон, Брэндон К. (2017-05-12). «Геномное исследование отдельных гигантских океанических вирусов» . Журнал ISME . 11 (8): 1736–1745. DOI : 10.1038 / ismej.2017.61 . ISSN 1751-7362 . PMC 5520044 . PMID 28498373 .
- ^ Степанаускас, Рамунас; Fergusson, Elizabeth A .; Браун, Джозеф; Поултон, Николь Дж .; Таппер, Бен; Лабонте, Джессика М .; Бекрафт, Эрик Д .; Браун, Юлия М .; Пачиадаки, Мария Г. (2017-07-20). «Улучшенное восстановление генома и интегрированный анализ размера отдельных некультивируемых микробных клеток и вирусных частиц» . Nature Communications . 8 (1): 84. Bibcode : 2017NatCo ... 8 ... 84S . DOI : 10.1038 / s41467-017-00128-Z . ISSN 2041-1723 . PMC 5519541 . PMID 28729688 .
- ^ Пачиадаки, Мария Г .; Синтес, Ева; Бергауэр, Кристин; Браун, Юлия М .; Запись, Николай Р .; Свон, Брэндон К .; Мэтье, Мэри Элизабет; Халлам, Стивен Дж .; Лопес-Гарсия, Purificacion (24 ноября 2017 г.). «Основная роль нитритокисляющих бактерий в фиксации углерода темного океана» . Наука . 358 (6366): 1046–1051. Bibcode : 2017Sci ... 358.1046P . DOI : 10.1126 / science.aan8260 . ISSN 0036-8075 . PMID 29170234 .
- ^ Coskun; Алсмади, О. (2007). «Амплификация всего генома из одной клетки: новая эра для преимплантационной генетической диагностики». Пренатальная диагностика . 27 (4): 297–302. DOI : 10.1002 / pd.1667 . PMID 17278176 . S2CID 22175397 .
- ^ Шоаиб; Baconnais, S; Mechold, U; Le Cam, E; Липинский, М; Огрызко, В (2008). «Множественная амплификация смещения для сложных смесей фрагментов ДНК» . BMC Genomics . 9 : 415. DOI : 10.1186 / 1471-2164-9-415 . PMC 2553422 . PMID 18793430 .