Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Массивное параллельное секвенирование или массивно-параллельное секвенирование - это любой из нескольких высокопроизводительных подходов к секвенированию ДНК, использующих концепцию массивно-параллельной обработки; это также называется секвенированием следующего поколения ( NGS ) или секвенированием второго поколения . Некоторые из этих технологий появились в 1994-1998 годах [1] [2] [3] [4] и были коммерчески доступны с 2005 года. Эти технологии используют миниатюрные и распараллеленные платформы для секвенирования от 1 миллиона до 43 миллиардов коротких чтений (50-400 баз каждое) на цикл прибора.

Многие платформы NGS различаются инженерными конфигурациями и химией секвенирования. Они разделяют техническую парадигму массивного параллельного секвенирования с помощью пространственно разделенных, клонально амплифицированных шаблонов ДНК или отдельных молекул ДНК в проточной ячейке . Эта схема сильно отличается от секвенирования по Сэнгеру, также известного как капиллярное секвенирование или секвенирование первого поколения, которое основано на электрофоретическом разделении продуктов обрыва цепи, полученных в отдельных реакциях секвенирования. [5]

Платформы NGS [ править ]

Секвенирование ДНК с помощью коммерчески доступных платформ NGS обычно проводится в следующие этапы. Во-первых, библиотеки секвенирования ДНК генерируются путем клональной амплификации с помощью ПЦР in vitro . Во-вторых, последовательность ДНК секвенируется путем синтеза , так что последовательность ДНК определяется добавлением нуклеотидов к комплементарной цепи, а не химическими методами обрыва цепи. В-третьих, пространственно сегрегированные, амплифицированные шаблоны ДНК секвенируются одновременно в массивно-параллельной манере без необходимости физического разделения. Хотя эти шаги выполняются на большинстве платформ NGS, каждая использует свою стратегию. [6]

NGS-распараллеливание реакций секвенирования генерирует от сотен мегабаз до гигабаз считываний нуклеотидных последовательностей за один прогон прибора. Это позволило резко увеличить количество доступных данных о последовательностях и коренным образом изменило подходы к секвенированию генома в биомедицинских науках. [7] Новые технологии и инструменты NGS внесли дополнительный вклад в значительное снижение стоимости секвенирования, приближающееся к отметке в 1000 долларов за секвенирование генома . [8] [9]

По состоянию на 2014 год коммерчески доступные платформы массового параллельного секвенирования, и их характеристики приведены в таблице. Поскольку технологии NGS быстро развиваются, технические характеристики и цены постоянно меняются.

Illumina HiSeq 2000 секвенирование машина
Платформы NGS
ПлатформаПодготовка шаблонаХимияМаксимальная длина чтения (базы)Время выполнения (дни)Макс.Гб на запуск
Рош 454Клонально-emPCRПиросеквенирование400 ‡0,420,40-0,60
GS FLX ТитанКлонально-emPCRПиросеквенирование400 ‡0,420,035
Illumina MiSeqКлональное усиление мостовидного протезаРеверсивный терминатор с красителем2x3000,17–2,715
Illumina HiSeqКлональное усиление мостовидного протезаРеверсивный терминатор с красителем2x1500,3-11 [10]1000 [11]
Анализатор генома Illumina IIXКлональное усиление мостовидного протезаОбратимый терминатор с красителем [12] [13]2x1502–1495
Life Technologies SOLiD4Клонально-emPCRОлигонуклеотидное 8-мерное цепное лигирование [14]20–454-735-50
Life Technologies Ion Proton [15]Клонально-emPCRНативные дНТФ, обнаружение протонов2000,5100
Полная геномикаСетчатые ДНК-наношарикиОлигонуклеотидное 9-мерное свободное лигирование [16] [17] [18]7x10113000
Helicos Biosciences HeliscopeОдиночная молекулаРеверсивный терминатор с красителем35 ‡825
Pacific Biosciences SMRTОдиночная молекулаФосфосвязанные флуоресцентные нуклеотиды10000 ( N50 ); 30 000+ (макс.) [19]0,080,5 [20]


Отмечаются время выполнения и выход в гигабайтах (Гб) за цикл для одностороннего секвенирования. Время работы и выходы примерно удваиваются при выполнении секвенирования с парным концом. ‡ Средняя длина чтения для платформ Roche 454 и Helicos Biosciences. [21]

Методы подготовки шаблонов для NGS [ править ]

При подготовке матриц для реакций NGS используются два метода: амплифицированные матрицы, происходящие из одиночных молекул ДНК, и шаблоны одиночных молекул ДНК. Для систем визуализации, которые не могут обнаруживать отдельные события флуоресценции, требуется амплификация шаблонов ДНК. Три наиболее распространенных метода амплификации - это эмульсионная ПЦР (emPCR), катящийся круг и твердофазная амплификация. Окончательное распределение шаблонов может быть случайным в пространстве или по сетке.

ПЦР эмульсии [ править ]

В методах эмульсионной ПЦР библиотека ДНК сначала создается путем случайной фрагментации геномной ДНК. Фрагменты одноцепочечной ДНК (матрицы) прикрепляются к поверхности бусинок с помощью адаптеров или линкеров, а одна бусина присоединяется к одиночному фрагменту ДНК из библиотеки ДНК. Поверхность шариков содержит олигонуклеотидные зонды с последовательностями, комплементарными адаптерам, связывающим фрагменты ДНК. Затем гранулы разделяют на капли водно-масляной эмульсии. В водно-масляной эмульсии каждая капля, захватывающая одну гранулу, представляет собой микрореактор ПЦР, который производит амплифицированные копии единой матрицы ДНК. [22] [23] [24]

Сетчатые наношары с катящимся кругом [ править ]

Амплификация популяции одиночных молекул ДНК путем амплификации по катящемуся кругу в растворе сопровождается захватом на сетке пятен, размер которых меньше размера ДНК, подлежащих иммобилизации. [25] [26] [27] [28]

Генерация колоний ДНК (Мостовая амплификация) [ править ]

Прямой и обратный праймеры ковалентно прикреплены к предметному стеклу в проточной ячейке с высокой плотностью. Отношение праймеров к матрице на носителе определяет поверхностную плотность амплифицированных кластеров. Проточная ячейка подвергается воздействию реагентов для удлинения на основе полимеразы , и праймирование происходит, когда свободный / дистальный конец лигированного фрагмента «соединяется» с комплементарным олиго на поверхности. Повторяющаяся денатурация и удлинение приводит к локальной амплификации фрагментов ДНК в миллионах отдельных мест на поверхности проточной кюветы. Твердофазная амплификация дает 100–200 миллионов пространственно разделенных кластеров матрицы, обеспечивая свободные концы, к которым затем гибридизируется универсальный праймер для секвенирования, чтобы инициировать реакцию секвенирования. [22][23] Эта технология была подана на патент в 1997 году в Женевском институте биомедицинских исследований Glaxo-Welcome (GBRI) Паскалем Майером, Эриком Кавашима и Лораном Фаринелли, [3] [4] и впервые была публично представлена ​​в 1998. [29] В 1994 году Крис Адамс и Стив Крон подали патент на аналогичный, но неклональный метод поверхностной амплификации, названный «мостовой амплификацией» [2], адаптированный для клональной амплификации в 1997 году Чёрчем и Митрой. [25] [26]

Одномолекулярные шаблоны [ править ]

Протоколы, требующие амплификации ДНК, часто трудны для реализации и могут привести к ошибкам при секвенировании. Подготовка шаблонов из одной молекулы более проста и не требует ПЦР, которая может привести к ошибкам в амплифицированных шаблонах. Последовательности-мишени, богатые AT и GC, часто демонстрируют систематическую ошибку амплификации, что приводит к их недопредставленности при выравнивании и сборках геномов. Матрицы одиночных молекул обычно иммобилизуют на твердых носителях с использованием одного из по крайней мере трех различных подходов. В первом подходе пространственно распределенные отдельные молекулы праймера ковалентно прикрепляются к твердой подложке. Матрица, которую получают путем случайного фрагментирования исходного материала на небольшие размеры (например, ~ 200–250 п.н.) и добавления общих адаптеров к концам фрагментов, затем гибридизируется с иммобилизованным праймером.Во втором подходе пространственно распределенные матрицы из одной молекулы ковалентно прикрепляются к твердой подложке путем праймирования и удлинения одноцепочечных матриц из одной молекулы из иммобилизованных праймеров. Затем с матрицей гибридизуют обычный праймер. В любом подходе ДНК-полимераза может связываться с иммобилизованной примированной конфигурацией матрицы, чтобы инициировать реакцию NGS. Оба вышеупомянутых подхода используются Helicos BioSciences. В третьем подходе пространственно распределенные одиночные молекулы полимеразы присоединяются к твердой подложке, с которой связана затравленная молекула-матрица. Этот подход используется Pacific Biosciences. С этим методом можно использовать более крупные молекулы ДНК (до десятков тысяч пар оснований), и, в отличие от первых двух подходов, третий подход можно использовать с методами в реальном времени,что приводит к потенциально большей длине чтения.

Подходы к секвенированию [ править ]

Пиросеквенирование [ править ]

В 1996 году Пол Нирен и его ученик Мостафа Ронаги из Королевского технологического института в Стокгольме опубликовали свой метод пиросеквенирования . [1] Пиросеквенирование - это неэлектрофоретический метод биолюминесценции, который измеряет высвобождение неорганического пирофосфата путем его пропорционального преобразования в видимый свет с помощью серии ферментативных реакций. В отличие от других подходов к секвенированию, в которых используются модифицированные нуклеотиды для прекращения синтеза ДНК, метод пиросеквенирования манипулирует ДНК-полимеразой путем однократного добавления dNTP.в предельных количествах. После включения комплементарного dNTP ДНК-полимераза удлиняет праймер и останавливается. Синтез ДНК возобновляется после добавления следующего комплементарного dNTP в цикле дозирования. Порядок и интенсивность световых пиков записываются в виде диаграмм, которые показывают лежащую в основе последовательность ДНК.[30]

Секвенирование с помощью химии обратимого терминатора [ править ]

В этом подходе используются dNTP, связанные с обратимым терминатором, в циклическом методе, который включает включение нуклеотидов, визуализацию флуоресценции и расщепление. Флуоресцентно меченый терминатор отображается при добавлении каждого dNTP, а затем его расщеплении для включения следующего основания. Эти нуклеотиды химически заблокированы, так что каждое включение является уникальным событием. За каждым этапом включения оснований следует этап визуализации, затем блокированная группа химически удаляется, чтобы подготовить каждую цепь для следующего включения ДНК-полимеразой. Эта серия шагов продолжается в течение определенного количества циклов, определяемого пользовательскими настройками прибора. 3'-блокирующие группы изначально задумывались как ферментативные [31] или как химические реверсивные [12] [13].Химический метод лег в основу машин Solexa и Illumina. Секвенирование с помощью химии обратимых терминаторов может быть четырехцветным циклом, используемым Illumina / Solexa, или одноцветным циклом, используемым Helicos BioSciences. Helicos BioSciences использовала «виртуальные терминаторы», которые представляют собой разблокированные терминаторы со вторым аналогом нуклеозида, который действует как ингибитор. Эти терминаторы имеют соответствующие модификации для терминирующих или ингибирующих групп, так что синтез ДНК прекращается после добавления одного основания. [23] [32] [33]

Последовательное лигирование, опосредованное ферментами лигазы [ править ]

В этом подходе реакция удлинения последовательности осуществляется не полимеразами, а скорее ДНК- лигазой и зондами, кодируемыми одним основанием, или зондами, кодируемыми двумя основаниями. В своей простейшей форме флуоресцентно меченый зонд гибридизуется со своей комплементарной последовательностью, смежной с примированной матрицей. Затем добавляют ДНК-лигазу, чтобы присоединить меченый красителем зонд к праймеру. Нелигированные зонды смывают с последующей флуоресцентной визуализацией для определения идентичности лигированного зонда. Цикл можно повторить либо с использованием расщепляемых зондов для удаления флуоресцентного красителя и регенерации группы 5'-PO4 для последующих циклов лигирования (цепное лигирование [14] [34] ), либо путем удаления и гибридизации нового праймера с матрицей (без цепочки). перевязка[16] [17] ).

Фосфосвязанные флуоресцентные нуклеотиды или секвенирование в реальном времени [ править ]

Pacific Biosciences в настоящее время является лидером этого метода. Метод секвенирования в реальном времени включает визуализацию непрерывного включения меченных красителем нуклеотидов во время синтеза ДНК: отдельные молекулы ДНК-полимеразы прикрепляются к нижней поверхности отдельных волноводных детекторов нулевого режима (детекторы Zmw), которые могут получать информацию о последовательности при фосфосвязанных нуклеотидах. внедряются в растущую цепь праймера. Pacific Biosciences использует уникальную ДНК-полимеразу, которая лучше включает фосфо-связанные нуклеотиды и позволяет повторно секвенировать замкнутые кольцевые шаблоны. В то время как точность однократного считывания составляет 87%, согласованная точность была продемонстрирована на уровне 99,999% при длине считывания в несколько килобаз. [35] [36]В 2015 году Pacific Biosciences выпустила новый инструмент для секвенирования под названием Sequel System, который увеличивает производительность примерно в 6,5 раз. [37] [38]

См. Также [ править ]

  • Клиническое метагеномное секвенирование

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б М. Ронаги; С. Карамохамед; Б. Петтерссон; М. Улен и П. Найрен (1996). «Секвенирование ДНК в реальном времени с использованием обнаружения высвобождения пирофосфата». Аналитическая биохимия . 242 (1): 84–9. DOI : 10.1006 / abio.1996.0432 . PMID  8923969 .
  2. ^ a b Патент США 5641658 Метод для выполнения амплификации нуклеиновой кислоты с двумя праймерами, связанными с одной твердой подложкой. Изобретатели: Кристофер П. Адамс, Стивен Джозеф Крон
  3. ^ a b заявка WO1998044151A1 , Лоран Фаринелли, Эрик Кавашима, Паскаль Майер, "Метод амплификации нуклеиновой кислоты", опубликовано 8 октября 1998 г. 
  4. ^ a b заявка WO1998044152A1 , Лоран Фаринелли, Эрик Кавашима, Паскаль Майер, «Метод секвенирования нуклеиновых кислот», опубликовано 8 октября 1998 г. 
  5. ^ Карл V. Voelkerding; Шале А. Дэймс и Джейкоб Д. Дурчи (2009). «Секвенирование следующего поколения: от фундаментальных исследований к диагностике» . Клиническая химия . 55 (4): 641–658. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112789 . PMID 19246620 . 
  6. ^ Мэтью В. Андерсон; Ирис Шрайвер (2010). «Секвенирование ДНК следующего поколения и будущее геномной медицины» . Гены . 1 (1): 38–69. DOI : 10,3390 / genes1010038 . PMC 3960862 . PMID 24710010 .  
  7. ^ Трейси Такер; Марко Марра и Ян М. Фридман (август 2009 г.). «Массивно параллельная последовательность - следующий большой шаг в генетической медицине» . Am J Hum Genet . 85 (2): 142–54. DOI : 10.1016 / j.ajhg.2009.06.022 . PMC 2725244 . PMID 19679224 .  
  8. ↑ Андреас фон Бубнофф (2008). «Секвенирование следующего поколения: гонка началась». Cell . 132 (5): 721–723. DOI : 10.1016 / j.cell.2008.02.028 . PMID 18329356 . S2CID 8413828 .  
  9. ^ «Выпуск 2008: NHGRI ищет технологии секвенирования ДНК, пригодные для повседневного лабораторного и медицинского использования» . Genome.gov . Проверено 5 августа 2012 .
  10. ^ "Архивная копия" . Архивировано из оригинала на 2014-12-06 . Проверено 6 ноября 2014 .CS1 maint: заархивированная копия как заголовок ( ссылка )
  11. ^ "Архивная копия" . Архивировано из оригинала на 2014-11-06 . Проверено 6 ноября 2014 .CS1 maint: заархивированная копия как заголовок ( ссылка )
  12. ^ a b Патент US7790869B2 , Цзинюэ Джу, Цзэнминь Ли, Джон Роберт Эдвардс, Ясухиро Итагаки, «Массивный параллельный метод декодирования ДНК и РНК», опубликован 07.09.2010 
  13. ^ a b Bentley DR и др. (6 ноября 2008 г.). «Точное секвенирование всего человеческого генома с использованием химии обратимых терминаторов» . Природа . 456 (7218): 53–9. Bibcode : 2008Natur.456 ... 53В . DOI : 10,1038 / природа07517 . PMC 2581791 . PMID 18987734 .  
  14. ^ а б МакКернан К.Дж. и др. (Сентябрь 2009 г.). «Последовательность и структурные вариации в геноме человека, выявленные путем короткого чтения, массивно параллельного секвенирования лигирования с использованием двухосновного кодирования» . Genome Res . 19 (9): 1527–41. DOI : 10.1101 / gr.091868.109 . PMC 2752135 . PMID 19546169 .  
  15. ^ "Ионный торрент" . Архивировано из оригинала на 30 декабря 2013 года . Дата обращения 1 января 2014 .
  16. ^ а б Drmanac R, et al. (2010). «Секвенирование генома человека с использованием несвязанного основания читает о самосборке нанометров ДНК». Наука . 327 (5961): 78–81. Bibcode : 2010Sci ... 327 ... 78D . DOI : 10.1126 / science.1181498 . PMID 19892942 . S2CID 17309571 .  
  17. ^ a b Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, McCutcheon JP, Rosenbaum AM, Wang MD, Zhang K, Mitra RD, Church GM (2005). «Точное мультиплексное секвенирование полонии развитого бактериального генома» . Наука . 309 (5741): 1728–32. Bibcode : 2005Sci ... 309.1728S . DOI : 10.1126 / science.1117389 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .  
  18. ^ Петерс Б.А. и др. (2012). «Точное секвенирование всего генома и гаплотипирование от 10-20 клеток человека» . Природа . 487 (7406): 190–195. Bibcode : 2012Natur.487..190P . DOI : 10.1038 / nature11236 . PMC 3397394 . PMID 22785314 .  
  19. ^ Pacific Biosciences представляет новую химию с большей длиной считывания для обнаружения новых особенностей в последовательности ДНК и продвинутых исследований генома крупных организмов
  20. ^ Лекс Недербрагт (2013-07-05). "Сборка бактериального генома de novo: решенная проблема?" .
  21. ^ Карл V. Voelkerding; Shale Dames и Джейкоб Д. Дурчи (сентябрь 2010 г.). «Диагностическая последовательность следующего поколения» . J Mol Diagn . 12 (5): 539–51. DOI : 10,2353 / jmoldx.2010.100043 . PMC 2928417 . PMID 20805560 .  
  22. ^ а б Чи-Сенг, Ку; Эн Юн, Лой; Юди, Павитан; и Ки-Сенг, Чиа. Технологии секвенирования нового поколения и их приложения. В: Энциклопедия наук о жизни (ELS). John Wiley & Sons, Ltd: Чичестер, апрель 2010 г.
  23. ^ a b c Metzker ML (январь 2010 г.). «Технологии секвенирования - новое поколение». Nat Rev Genet . 11 (1): 31–46. DOI : 10.1038 / nrg2626 . PMID 19997069 . S2CID 205484500 .  
  24. ^ Dressman Д, Ян Н, Traverso G, Кинзлер кВт, Фогельштейна В (22 июля 2003). «Преобразование отдельных молекул ДНК в флуоресцентные магнитные частицы для обнаружения и подсчета генетических вариаций» . Proc Natl Acad Sci USA . 100 (15): 8817–22. Bibcode : 2003PNAS..100.8817D . DOI : 10.1073 / pnas.1133470100 . PMC 166396 . PMID 12857956 .  
  25. ^ Б патент US6485944B1 , Джордж Чёрч, Роб Митра, «Replica усиление кислотных массивов нуклеиновых», опубликованной 2002-11-26 
  26. ^ a b Mitra R, Church GM (декабрь 1999 г.). «Локализованная амплификация in situ и контактная репликация многих индивидуальных молекул ДНК» . Nucleic Acids Res . 27 (24): e34, 1–6. DOI : 10.1093 / NAR / 27.24.e34 . PMC 148757 . PMID 10572186 .  
  27. ^ заявка WO2007120208A3 , Джордж М. Черч, Грегори Дж. Поррека, Абрахам Розенбаум, Джей Шендуре, «Последовательность ДНК с вращающимся кругом с помощью наносетки», опубликовано 28 августа 2008 г. 
  28. ^ патент US8445194B2 , Radoje Drmanac, Matthew J. Callow, Snezana Drmanac, Brian K. Hauser, George Yeung, «Массивы одиночных молекул для генетического и химического анализа», опубликовано 21 мая 2013 г. 
  29. ^ П. Майер и др., Представленные на Пятой Международной конференции по автоматизации в картировании и секвенировании ДНК, Сент-Луис, Миссури, США (7–10 октября 1998 г.). Массовое параллельное секвенирование колоний ДНК Презентация ams98 «Очень крупномасштабный, высокопроизводительный и недорогой метод секвенирования ДНК, основанный на новом двухмерном процессе авто-паттерна ДНК» Проверить значение ( справка ) .|url=CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  30. ^ Высокопроизводительное секвенирование ДНК - концепции и ограничения, Мартин Кирчер и Джанет Келсо, Bioessays 32: 524–536, 2010 WILEY Periodicals Inc.
  31. ^ заявка WO2001023610A2 , Шанкар Баласубраманиан, «Полинуклеотидное секвенирование», опубликовано 05.04.2001. 
  32. ^ «Пробирная технология» . Иллюмина. Архивировано из оригинала на 2012-08-26 . Проверено 5 августа 2012 .
  33. ^ «Настоящее секвенирование одной молекулы (tSMS ™): Helicos BioSciences» . Helicosbio.com. Архивировано из оригинала на 2012-03-11 . Проверено 5 августа 2012 .
  34. ^ «Основы 2-х базового кодирования и цветового пространства» . Appliedbiosystems.cnpg.com . Проверено 5 августа 2012 .
  35. ↑ Chin CS, Alexander DH, Marks P, Klammer AA, Drake J, Heiner C, Clum A, Copeland A, Huddleston J, Eichler EE, Turner SW, Korlach J (июнь 2013 г.). «Негибридные, готовые сборки микробного генома на основе данных секвенирования SMRT с длинным считыванием». Нат методы . 10 (6): 563–9. DOI : 10.1038 / nmeth.2474 . PMID 23644548 . S2CID 205421576 .  
  36. ↑ Моника Хегер (5 марта 2013 г.). «Пользователи PacBio сообщают о прогрессе в долгих чтениях для сборки генома растений, сложных областях генома человека» .
  37. ^ «PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования одной молекулы» .
  38. ^ http://www.bio-itworld.com/2015/9/30/pacbio-announces-sequel-sequencing-system.aspx