Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из Microscale Thermophoresis )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Принцип технологии MST: MST выполняется в тонких капиллярах в свободном растворе, что обеспечивает условия, близкие к нативным (без иммобилизации в любом буфере, даже в сложных биожидкостях), и инструмент, не требующий обслуживания. При выполнении эксперимента MST инфракрасный лазер индуцирует микроскопический температурный градиент, и обнаруживают TRIC, а также термофорез. TRIC зависит от микросреды флуорофора, которая обычно изменяется в событиях связывания. Термофорез, движение молекулы в температурном градиенте, зависит от трех параметров, которые обычно меняются при взаимодействии. Таким образом, общий сигнал MST наносится на график в зависимости от концентрации лиганда для получения кривой доза-ответ, из которой можно вывести аффинность связывания.

Микромасштабный термофорез ( MST ) - это технология биофизического анализа взаимодействий между биомолекулами . Микромасштабный термофорез основан на обнаружении вызванного температурой изменения флуоресценции мишени в зависимости от концентрации нефлуоресцентного лиганда. Наблюдаемое изменение флуоресценции основано на двух различных эффектах. С одной стороны, он основан на изменении интенсивности, зависящей от температуры (TRIC) флуоресцентного зонда, на которое могут влиять события связывания. С другой стороны, он основан на термофорезе , направленном движении частиц в микроскопическом температурном градиенте.. Любое изменение химического микроокружения флуоресцентного зонда, а также изменения гидратной оболочки биомолекул приводят к относительному изменению флуоресценции, обнаруживаемой при применении температурного градиента, и могут использоваться для определения аффинности связывания . MST позволяет измерять взаимодействия непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхности (технология без иммобилизации).

Приложения [ править ]

Родство [ править ]

Стехиометрия

Термодинамические параметры [ править ]

MST использовался для оценки энтальпийного и энтропийного вкладов в биомолекулярные взаимодействия. [10]

Дополнительная информация [ править ]

  • Свойство образца (однородность, агрегация, стабильность)
  • Множественные сайты привязки, сотрудничество

Технология [ править ]

MST основан на количественном обнаружении изменения флуоресценции в образце при изменении температуры. Флуоресценция целевой молекулы может быть внешней или внутренней (ароматические аминокислоты ) и изменяется в зависимости от температурных градиентов из-за двух различных эффектов. С одной стороны, изменение интенсивности, связанное с температурой (TRIC), которое описывает внутреннее свойство флуорофоров изменять интенсивность своей флуоресценции в зависимости от температуры. На степень изменения интенсивности флуоресценции влияет химическая среда флуоресцентного зонда, которая может изменяться в событиях связывания из-за конформационных изменений или близости лигандов . [11] [12]С другой стороны, MST также основан на направленном движении молекул по температурным градиентам - эффекту, называемому термофорезом. Пространственная разница температур ΔT приводит к изменению концентрации молекул в области повышенной температуры, количественно определяемой коэффициентом Soret S T : c hot / c cold = exp (-S T ΔT). [13] [14]И TRIC, и термофорез вносят вклад в регистрируемый сигнал при измерениях MST следующим образом: ∂ / ∂T (cF) = c∂F / ∂T + F∂c / ∂T. Первый член в этом уравнении c∂F / ∂T описывает TRIC как изменение интенсивности флуоресценции (F) как функцию температуры (T), тогда как второй член F∂c / ∂T описывает термофорез как изменение концентрации частиц (c) как функция температуры. Термофорез зависит от границы раздела между молекулой и растворителем. В условиях постоянного буфера термофорез исследует размер, заряд и энтропию сольватации молекул. Термофорез флуоресцентно меченой молекулы A обычно значительно отличается от термофореза комплекса молекула-мишень AT из-за различий в размере, заряде и энтропии сольватации. Эта разница в молекуле 's термофорез используется для количественной оценки связывания в экспериментах по титрованию при постоянных условиях буфера.

Термофоретическое движение флуоресцентно меченой молекулы измеряется путем отслеживания распределения флуоресценции F внутри капилляра. Микроскопический температурный градиент создается инфракрасным лазером, который фокусируется в капилляр и сильно поглощается водой. Температура водного раствора в лазерном пятне повышается на ΔT = 1-10 К. Перед включением ИК-лазера внутри капилляра наблюдается однородное распределение флуоресценции F холода . Когда ИК-лазер включен, два эффекта, происходят на том же временном масштабе, способствуя новому распределению флуоресценции F горячей. Термическая релаксация вызывает зависящее от связывания падение флуоресценции красителя из-за его локальной реакции, зависящей от окружающей среды, на скачок температуры (TRIC). В то же время молекулы обычно перемещаются из локально нагретой области во внешние холодные области. Локальная концентрация молекул уменьшается в нагретой области до достижения стационарного распределения.

В то время как массовая диффузия D диктует кинетику истощения, S T определяет установившееся соотношение концентраций c hot / c cold = exp (-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT при повышении температуры ΔT. Нормализованная флуоресценция F norm = F hot / F cold измеряет в основном это соотношение концентраций в дополнение к TRIC ∂F / ∂T. В линейном приближении находим: F norm = 1 + (∂F / ∂TS T ) ΔT. Из-за линейности интенсивности флуоресценции и термофоретического истощения нормированная флуоресценция от несвязанной молекулы F norm (A) и связанного комплекса Fnorm (AT) накладываются линейно. Обозначая x фракцию молекул, связанных с мишенями, изменяющийся сигнал флуоресценции во время титрования мишени T определяется следующим образом: F norm = (1-x) F norm (A) + x F norm (AT). [11]

Количественные параметры связывания получают с помощью серийного разведения связывающего субстрата. Построив F нормы против логарифма различных концентраций серии разведений, получают сигмоидальную кривую связывания. Эта привязка кривой может быть непосредственно установлены с нелинейным раствором закона действующих масс , с константой диссоциации K D в качестве результата. [15] [16] [17]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Asmari МЫ, Ratih R, Alhazmi HA, Эль - Диб S (февраль 2018). «Термофорез для характеристики биомолекулярного взаимодействия» (PDF) . Методы . 146 : 107–119. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2018.02.003 . PMID  29438829 .
  2. ^ Мюллер AM, Breitsprecher D, Duhr S, Baaske P, Schubert T, Längst G (2017). «Micro Scale Термофорез: Быстрые и точный метод для количественного определения белковых-нуклеиновых взаимодействий в растворе». Термофорез MicroScale: быстрый и точный метод количественной оценки взаимодействия белков и нуклеиновых кислот в растворе . Методы молекулярной биологии. 1654 . С. 151–164. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-7231-9_10 . ISBN 978-1-4939-7230-2. PMID  28986788 .
  3. ^ Filarsky МЫ, Zillner К, Арай я, Вильяр-Garea А, Merkl R, G Längst, Немет А (2015). «Удлиненный АТ-крючок - это новый мотив связывания РНК» . Биология РНК . 12 (8): 864–76. DOI : 10.1080 / 15476286.2015.1060394 . PMC 4615771 . PMID 26156556 .  
  4. ^ a b Зайдель С.А., Дейкман П.М., Леа В.А., ван ден Богаарт Г., Джерабек-Виллемсен М., Лазич А. и др. (2013). «Микромасштабный термофорез позволяет количественно оценить биомолекулярные взаимодействия в ранее сложных условиях» . Методы . 59 (3): 301–15. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2012.12.005 . PMC 3644557 . PMID 23270813 .  
  5. ^ Сейдел С.А., Wienken CJ, Гейсслер S, Jerabek-Willemsen М, Duhr S, Рейтер А, Trauner Д, Браун Д, Baaske Р (2012). «Микромасштабный термофорез без метки позволяет различать сайты и аффинность связывания белок-лиганд» . Энгью. Chem. Int. Эд. Англ . 51 (42): 10656–9. DOI : 10.1002 / anie.201204268 . PMC 3588113 . PMID 23001866 .  
  6. ^ Линке Р, Amaning К, Maschberger М, Vallee Ж, Steier В, Р Baaske, Duhr S, Breitsprecher D, Рак А (апрель 2016). «Автоматизированный подход микромасштабного скрининга термофореза для обнаружения свинца на основе фрагментов» . Журнал биомолекулярного скрининга . 21 (4): 414–21. DOI : 10.1177 / 1087057115618347 . PMC 4800460 . PMID 26637553 .  
  7. ^ Jerabek-Willemsen M, Wienken CJ, Braun D, Baaske P, Duhr S (август 2011). «Изучение молекулярного взаимодействия с использованием термофореза на микромасштабах» . Технологии анализа и разработки лекарств . 9 (4): 342–53. DOI : 10.1089 / adt.2011.0380 . PMC 3148787 . PMID 21812660 .  
  8. ^ Dijkman PM, Watts A (ноябрь 2015). «Липидная модуляция ранних событий передачи сигналов рецептора, связанного с G-белком» . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Биомембраны . 1848 (11 Pt A): 2889–97. DOI : 10.1016 / j.bbamem.2015.08.004 . PMID 26275588 . 
  9. ↑ Виланова О., Миттаг Дж. Дж., Келли П. М., Милани С., Доусон К. А., Редлер Дж. О., Францезе Г. (декабрь 2016 г.). «Понимание кинетики образования короны белок-наночастиц» . САУ Нано . 10 (12): 10842–10850. DOI : 10.1021 / acsnano.6b04858 . PMC 5391497 . PMID 28024351 .  
  10. ^ Jerabek-Willemsen М, Андре Т, Wanner А, Рот НМ, Duhr S, Baaske Р, Breitsprecher D (2014). «MicroScale Thermophoresis: анализ взаимодействия и не только» . Журнал молекулярной структуры . 1077 : 101–113. Bibcode : 2014JMoSt1077..101J . DOI : 10.1016 / j.molstruc.2014.03.009 .
  11. ^ a b Baaske P, Wienken CJ, Reineck P, Duhr S, Braun D (2010). «Оптический термофорез для количественной оценки буферной зависимости связывания аптамера». Энгью. Chem. Int. Эд. Англ . 49 (12): 1–5. DOI : 10.1002 / anie.200903998 . PMID 20186894 . Краткое содержание - Phsyorg.com . 
  12. ^ Гупта AJ, Duhr S, Baaske P (2018). Микромасштабный термофорез (MST) . Энциклопедия биофизики . С. 1–5. DOI : 10.1007 / 978-3-642-35943-9_10063-1 . ISBN 9783642359439.
  13. ^ Duhr S, Braun D (2006). «Почему молекулы движутся по температурному градиенту» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 103 (52): 19678–82. Bibcode : 2006PNAS..10319678D . DOI : 10.1073 / pnas.0603873103 . PMC 1750914 . PMID 17164337 .  
  14. ^ Reineck P, Wienken CJ, Braun D (2010). «Термофорез одноцепочечной ДНК». Электрофорез . 31 (2): 279–86. DOI : 10.1002 / elps.200900505 . PMID 20084627 . S2CID 36614196 .  
  15. ^ Wienken CJ, Baaske Р, Rothbauer U, Браун Д, Duhr S (2010). «Анализы связывания белков в биологических жидкостях с использованием термофореза на микроуровне» . Nat Commun . 1 (7): 100. Bibcode : 2010NatCo ... 1..100W . DOI : 10.1038 / ncomms1093 . PMID 20981028 . 
  16. ^ Baaske Р, Wienken С, Duhr S (2009). "Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik" [Оптически генерируемый термофорез для биоанализа] (PDF) . Биофотоник (на немецком языке): 22–24.[ мертвая ссылка ]
  17. ^ Wienken CJ, Baaske P, S Duhr, Braun D (2011). «Кривые термофоретического плавления количественно определяют конформацию и стабильность РНК и ДНК» . Nucleic Acids Res . 39 (8): e52. DOI : 10.1093 / NAR / gkr035 . PMC 3082908 . PMID 21297115 .