Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Оптическая плотность образца рибосомы. Обозначены важные длины волн 260 и 280 нм.

В молекулярной биологии , количественный анализ нуклеиновых кислот обычно проводятся для определения средних концентраций ДНК или РНК , присутствующие в смеси, а также их чистоты. Реакции, в которых используются нуклеиновые кислоты, часто требуют определенных количеств и чистоты для оптимальной работы. На сегодняшний день ученые используют два основных подхода для количественного определения или определения концентрации нуклеиновых кислот (таких как ДНК или РНК) в растворе. Это спектрофотометрический количественный анализ и УФ-флуоресцентная маркировка в присутствии красителя ДНК. [ необходима цитата ]

Спектрофотометрический анализ [ править ]

Одним из наиболее часто используемых методов количественного определения ДНК или РНК является использование спектрофотометрического анализа с использованием спектрофотометра . [1] спектрофотометр способен определить средние концентрации нуклеиновых кислот ДНК или РНК , присутствующие в смеси, а также их чистота.

Спектрофотометрический анализ основан на принципах, согласно которым нуклеиновые кислоты поглощают ультрафиолетовый свет определенным образом. В случае ДНК и РНК образец подвергается воздействию ультрафиолетового света с длиной волны 260 нанометров (нм), и фотодетектор измеряет свет, который проходит через образец. Часть ультрафиолетового света проходит, а часть поглощается ДНК / РНК. Чем больше света поглощается образцом, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце. В результате на фотодетектор попадет меньше света, что приведет к более высокой оптической плотности (OD).

Используя закон Бера – Ламберта , можно связать количество поглощенного света с концентрацией поглощающей молекулы. При длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двухцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг / мл) -1 см -1 , для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг / мл) -1 см -1 , для одноцепочечной ДНК. -цепочечной РНК она составляет 0,025 (мкг / мл) -1 см -1, а для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов она зависит от длины и состава оснований. Таким образом, абсорбция (A) , равная 1, соответствует концентрации 50 мкг / мл для двухцепочечной ДНК. Этот метод расчета действителен для оценок не ниже 2.[2] Для олигонуклеотидов может потребоваться более точный коэффициент экстинкции; их можно предсказать, используя модель ближайшего соседа . [3]

Расчеты [ править ]

Оптическая плотность [4] вычисляется из уравнения:

Оптическая плотность = Log (интенсивность падающего света / интенсивность
проходящего света)

На практике образец, не содержащий ДНК или РНК, не должен
поглощать ультрафиолетовый свет и, следовательно, давать ОП равную 0.

Оптическая плотность = Log (100/100) = 0

При использовании спектрофотометрического анализа для определения концентрации ДНК или РНК закон Бера-Ламберта используется для определения неизвестных концентраций без необходимости построения стандартных кривых. По сути, закон Бера-Ламберта позволяет связать количество поглощенного света с концентрацией поглощающей молекулы. Следующие единицы абсорбции в коэффициенты преобразования концентрации нуклеиновой кислоты используются для преобразования OD в концентрацию неизвестных образцов нуклеиновой кислоты:

A260 дцДНК = 50 мкг / мл
A260 оцДНК = 33 мкг / мл
A260 оцРНК = 40 мкг / мл

Коэффициенты пересчета [ править ]

При использовании длины пути 10 мм просто умножьте OD на коэффициент преобразования, чтобы определить концентрацию. Пример: образец дцДНК с оптической плотностью 2,0 соответствует образцу с концентрацией 100 мкг / мл.

При использовании длины пути короче 10 мм результирующий наружный диаметр будет уменьшен в 10 раз на длину пути. Используя приведенный выше пример с длиной оптического пути 3 мм, ОП для образца 100 мкг / мл будет уменьшена до 0,6. Чтобы нормализовать концентрацию до эквивалента 10 мм, делают следующее:

0,6 OD X (10/3) * 50 мкг / мл = 100 мкг / мл

Большинство спектрофотометров позволяют выбирать тип нуклеиновой кислоты и длину пути, так что результирующая концентрация нормализуется до длины пути 10 мм, что основано на принципах закона Бера .

A260 как измерение количества [ править ]

«Единица A260» используется как мера количества нуклеиновых кислот. Одна единица A260 - это количество нуклеиновой кислоты, содержащееся в 1 мл и обеспечивающее ОП, равное 1. Применяются те же коэффициенты пересчета и, следовательно, в таких контекстах:

1 единица A260 дцДНК = 50 мкг
1 единица A260 оцДНК = 33 мкг
1 единица A260 оцРНК = 40 мкг

Чистота образца (соотношение 260: 280/260: 230) [ править ]

Образцы нуклеиновой кислоты обычно загрязнены другими молекулами (например, белками, органическими соединениями и т. Д.). Дополнительным преимуществом использования спектрофотометрического анализа для количественного определения нуклеиновых кислот является возможность определения чистоты образца с использованием расчета 260 нм: 280 нм. Отношение оптической плотности при 260 и 280 нм (A 260/280 ) используется для оценки чистоты нуклеиновых кислот. Для чистой ДНК широко считается , что A 260/280 составляет ~ 1,8, но, как утверждается, из-за числовых ошибок в оригинальной статье Варбурга он переводится в смесь 60% белка и 40% ДНК. [5] Соотношение для чистой РНК A 260/280составляет ~ 2.0. Эти соотношения обычно используются для оценки количества белкового загрязнения, оставшегося после процесса выделения нуклеиновой кислоты, поскольку белки поглощают при 280 нм.

Отношение поглощения при 260 нм против 280 нм обычно используется для оценки загрязнения ДНК белковых растворов, поскольку белки (в частности, ароматические аминокислоты) поглощают свет при 280 нм. [2] [6] Обратное, однако, неверно - требуется относительно большое количество белкового загрязнения, чтобы существенно повлиять на соотношение 260: 280 в растворе нуклеиновой кислоты. [2] [5]

Соотношение 260: 280 имеет высокую чувствительность к контаминации нуклеиновых кислот в белке:

% белка% нуклеиновая кислотаСоотношение 260: 280
10000,57
9551.06
90101,32
70301,73

Соотношение 260: 280 не чувствительно к загрязнению белков в нуклеиновых кислотах (таблица показана для РНК, 100% ДНК составляет приблизительно 1,8):

% нуклеиновая кислота% белкаСоотношение 260: 280
10002,00
9551,99
90101,98
70301,94

Это различие связано с гораздо более высоким массовым коэффициентом ослабления нуклеиновых кислот при 260 и 280 нм по сравнению с белками. Из-за этого, даже при относительно высоких концентрациях белка, белок вносит относительно небольшой вклад в поглощение 260 и 280. Хотя белковое загрязнение не может быть надежно оценено с соотношением 260: 280, это также означает, что оно вносит небольшую ошибку в оценку количества ДНК.

Идентификация загрязнения [ править ]

Исследование спектров пробы может быть полезно для определения наличия проблемы с чистотой пробы.

Таблица потенциальных факторов загрязнения [7]
СоотношениеНизкое чтениеВысокое чтение
A260 / A230
  • Унос углеводов (часто проблема с растениями)
  • Остаточный фенол от экстракции нуклеиновой кислоты
  • Остаточный гуанидин (часто используется в наборах на основе колонок)
  • Гликоген используется для осаждения.
  • Выполнение пустого измерения на грязном постаменте.
  • Использование неподходящего раствора для холостого измерения. Контрольный раствор должен иметь такой же pH и такую ​​же ионную силу, что и раствор образца. Пример: использование воды для холостого измерения образцов, растворенных в ТЕ, может привести к низким отношениям 260/230.
A260 / A280
  • Остаточный фенол или другой реагент, связанный с протоколом экстракции.
  • Очень низкая концентрация (<10 нг / мкл) нуклеиновой кислоты.
  • Остаточная РНК от экстракции нуклеиновой кислоты.

* Высокое соотношение чистоты 260/280 обычно не указывает на какие-либо проблемы.

Другие распространенные загрязнители [ править ]

  • Загрязнение фенолом , который обычно используется при очистке нуклеиновых кислот, может существенно повлиять на количественные оценки. Фенол абсорбирует с пиком при 270 нм и A 260/280 1,2. Препараты нуклеиновых кислот, не загрязненные фенолом, должны иметь A 260/280 около 2. [2] Загрязнение фенолом может значительно способствовать завышению концентрации ДНК.
  • Поглощение при 230 нм может быть вызвано загрязнением ионами фенолята , тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для образца чистой РНК A 230: 260: 280 должно быть примерно 1: 2: 1, а для образца чистой ДНК A 230: 260: 280 должно быть примерно 1: 1,8: 1. [8]
  • Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на загрязнение раствора частицами, вызывающими рассеяние света в видимом диапазоне. Значение в образце чистой нуклеиновой кислоты должно быть нулевым. [ необходима цитата ]
  • Отрицательные значения могут быть получены, если неправильное решение было использовано как пустое. В качестве альтернативы эти значения могут возникать из-за флуоресценции красителя в растворе.

Анализ с использованием флуоресцентных красителей [ править ]

Альтернативный метод оценки концентрации ДНК и РНК - пометить образец флуоресцентной меткой , которая представляет собой флуоресцентный краситель, используемый для измерения интенсивности красителей, которые связываются с нуклеиновыми кислотами и избирательно флуоресцируют при связывании (например, бромид этидия ). Этот метод полезен в случаях, когда концентрация слишком мала для точной спектрофотометрической оценки, а также в случаях, когда загрязняющие вещества, поглощающие на длине волны 260 нм, делают невозможным точное количественное определение этим методом. Преимущество количественного определения флуоресценции ДНК и РНК заключается в большей чувствительности по сравнению со спектрофотометрическим анализом . Хотя такое увеличение чувствительности происходит за счет более высокой цены за образец и более длительного использования.процесс подготовки образца .

Есть два основных подхода к этому. «Пятно» включает нанесение образца непосредственно на агарозный гель или полиэтиленовую пленку . Флуоресцентный краситель либо присутствует в агарозном геле, либо добавляется в соответствующих концентрациях к образцам на пластиковой пленке. Рядом с образцом наносится набор образцов с известными концентрациями. Затем оценивается концентрация неизвестного образца путем сравнения с флуоресценцией этих известных концентраций. В качестве альтернативы можно пропустить образец через агарозный или полиакриламидный гель вместе с некоторыми образцами известной концентрации. Как и в случае точечного теста, концентрация оценивается путем сравнения интенсивности флуоресценции с известными образцами. [2]

Если объемы образцов достаточно велики для использования микропланшетов или кювет , образцы с красителем также могут быть количественно определены с помощью флуоресцентного фотометра . Минимальный объем образца начинается с 0,3 мкл [9]

На сегодняшний день не существует метода флуоресценции для определения белковой контаминации образца ДНК, аналогичного спектрофотометрической версии 260 нм / 280 нм.

См. Также [ править ]

  • Методы нуклеиновой кислоты
  • Фенол-хлороформная экстракция
  • Очистка колонки
  • Белковые методы

Ссылки [ править ]

  1. ^ Huss, Volker AR; Фестл, Герберт; Шлейфер, Карл Хайнц (1983). «Исследования по спектрофотометрическому определению гибридизации ДНК по скорости ренатурации». Систематическая и прикладная микробиология . 4 (2): 184–192. DOI : 10.1016 / S0723-2020 (83) 80048-4 . ISSN  0723-2020 . PMID  23194591 .
  2. ^ а б в г е Sambrook & Russell (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (3-е изд.). Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор . ISBN 978-0-87969-577-4.
  3. ^ Татауров А.В.; Вы Y .; Овчарзы Р. (2008). «Прогнозирование ультрафиолетового спектра одноцепочечных и двухцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислот». Биофиз. Chem . 133 (1–3): 66–70. DOI : 10.1016 / j.bpc.2007.12.004 . PMID 18201813 . 
  4. ^ ИЮПАК, Сборник химической терминологии . Интернет-издание: «Поглощение».
  5. ^ а б Глазель Дж. (1995). «Достоверность чистоты нуклеиновых кислот, контролируемая по соотношениям поглощения 260/280». Биотехнологии . 18 (1): 62–63. PMID 7702855 . )
  6. ^ (Sambrook и Рассел ссылается на оригинальный документ: . Варбург, О. & Кристиан В. (1942) "унд Isolierung Kristallisation де Gärungsferments енолаза". Biochem Z. . 310 : 384-421.)
  7. ^ «Оценка чистоты нуклеиновых кислот» (PDF) . Thermo Scientific . Проверено 28 сентября 2016 .
  8. ^ «Анализ ДНК или РНК с использованием ее длин волн: 230 нм, 260 нм, 280 нм» . Bioteachnology.com. 2010-01-13. Архивировано из оригинала на 2012-09-06 . Проверено 12 марта 2010 .
  9. ^ Точность и воспроизводимость количественного определения нуклеиновых кислот

Внешние ссылки [ править ]

  • Онлайн-инструмент IDT для прогнозирования УФ-спектра поглощения нуклеотидов
  • Руководство Ambion по количественному определению РНК
  • Хиллари Люббехузен, Значение отношения 260/230 в определении чистоты нуклеиновых кислот (документ в формате pdf)
  • двухцепочечная, одноцепочечная ДНК и количественное определение РНК по абсорбции 260 нм, лаборатория Sauer в OpenWetWare
  • Веб-приложение от поглощения до концентрации @ DNA.UTAH.EDU
  • Точность и воспроизводимость количественного определения нуклеиновых кислот